本文關(guān)鍵詞：ROCK1介導慢性腎臟病引起的蛋白質(zhì)能量消耗發(fā)病機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:1、探討慢性腎臟病激活ROCK1增加肌肉分解代謝促進肌肉萎縮的新機制。2、探究藥物抑制ROCK1能否逆轉(zhuǎn)慢性腎臟病所致的肌肉萎縮。方法:1、健康雄性8周齡C57BL6小鼠30只,體質(zhì)量20~25g,分為4組:(1)正常對照組(CTL),(2)法舒地爾組(Fasudil,F),(3)慢性腎臟病組(chronic kidney disease,CKD),(4)慢性腎臟病+法舒地爾組(CKD+F);配對喂養(yǎng)野生型與基因敲除小鼠,8周齡,雄性,共24只,分為四組:(1)ROCK1~(+/+)假手術(shù)組,5只,(2)ROCK1~(-/-)假手術(shù)組,5只,(3)ROCK1~(+/+)CKD組,7只(4)ROCK1~(-/-)CKD組,7只。正常飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后,CKD與CKD+F組,ROCK1~(+/+)CKD與ROCK1~(-/-)CKD組行腎臟5/6切除術(shù),術(shù)后2周后予高蛋白飲食促進CKD模型成立。術(shù)后8周后測血肌酐、尿素氮。F組和CKD+F組予法舒地爾50mg/(kg·d)腹腔注射,持續(xù)6周。處死留取靜脈血和肌肉。2、用含10%胎牛血清(FBS)和1%P-S的DMEM培育C2C12細胞,鋪滿六孔板面積約80%時換用含2%馬血清(HS)的DMEM。至細胞分化成條狀后,根據(jù)實驗相應(yīng)加入M-Fv-Casp3、AP20187及Fasudil(100μg/ml),分別處理48、24、24小時后刮取細胞留用。3、形態(tài)學觀察:抗層黏蛋白免疫熒光染色:測肌肉橫截面積及肌肉中ROCK1的表達;Western blot、免疫共沉淀、ELISA:檢測PTEN、ROCK1、Rho A、PI3K、Akt的活性及p-MYPT、p-GSK3β、GAPDH的含量;RT-PCR:檢測肌肉萎縮蛋白(Atrogin-1/MAFbx)和肌環(huán)脂蛋白(MuRF-1)mRNA的表達變化;同位素法:測趾長伸肌和比目魚肌的蛋白降解率。4、所有計數(shù)結(jié)果用SPSS 19.0軟件行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。結(jié)果:1、CKD抑制PI3K的活性但Akt活性下降更為顯著,且PTEN被激活:CKD時肌肉中的PI3K和Akt的活性均受抑制(P0.05,P0.01),但Akt活性的下降更為顯著(P0.01)。PTEN的活性較對照組上升2.3倍(P0.05)。因此認為PTEN活性的升高是介導Akt活性下降的另一重要因素。2、ROCK1在CKD小鼠的骨骼肌中被激活:CKD小鼠的骨骼肌中ROCK1剪切片段升高,ROCK1活性升高2.6倍(P0.01),Rho A GTP酶的活性較對照組無顯著差異。提示CKD小鼠的肌肉中ROCK1通過剪切被激活。3、ROCK1全身敲除可延緩CKD導致的肌肉萎縮:ROCK1~(+/+)假手術(shù)組與ROCK1~(-/-)假手術(shù)組小鼠的肌纖維橫截面積分布率無顯著差異,而ROCK1~(-/-)CKD組小鼠的肌纖維橫截面積分布率相較于ROCK1~(+/+)CKD組顯著右移。ROCK1~(+/+)假手術(shù)組與ROCK1~(-/-)假手術(shù)組小鼠肌肉蛋白降解率的差異不顯著(P0.05),而ROCK1~(-/-)CKD組小鼠的肌肉蛋白降解率相較于ROCK1~(+/+)CKD組顯著下降(P0.05)。對比于ROCK1~(+/+)CKD組,Atrogin-1和MuRF-1的mRNA水平在ROCK1~(-/-)CKD組小鼠中顯著降低(P0.01),而該組的Akt活性較高,PTEN活性較弱(P0.01)。推測小鼠CKD時激活ROCK1,繼而激活PTEN,引起Akt活性下降,而ROCK1基因敲除可抑制該現(xiàn)象。4、激活的ROCK1通過PTEN抑制Akt的活性:C2C12細胞用Caspase-3激活ROCK1后PTEN活性顯著升高(P0.01),Akt活性顯著下降。Fasudil可抑制PTEN活性(P0.05),促進Akt激活。推測激活的ROCK1升高了PTEN的活性從而抑制Akt的活性。5、ROCK1抑制劑法舒地爾可延緩CKD小鼠的肌肉萎縮:CKD組小鼠的肌力較對照組顯著下降,法舒地爾則可改善小鼠CKD引起的肌力降低(P0.05)。脛骨前肌、趾長伸肌和比目魚肌稱重可得,CKD明顯降低了小鼠的肌肉重量,該癥狀經(jīng)法舒地爾干預(yù)后可得緩解(P0.05),體質(zhì)量經(jīng)法舒地爾干預(yù)后有所回升(P0.05)。法舒地爾可增加CKD小鼠肌纖維橫截面積(P0.05),使肌纖維橫截面積分布率較CKD組右移。與此同時,法舒地爾干預(yù)后,磷酸化Akt的水平較CKD組顯著回升(P0.05),Atrogin-1和MuRF-1 mRNA表達下降(P0.01)。由此可得ROCK1抑制劑對CKD所致肌肉萎縮的治療作用。結(jié)論:1、慢性腎臟病時ROCK1的激活介導了PTEN活化,抑制Akt的活性從而增加Atrogin-1和MuRF-1的表達,促進肌肉萎縮。2、法舒地爾可延緩慢性腎臟病所致的肌肉萎縮,為臨床治療提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：慢性腎臟病 ROCK1 肌肉萎縮 法舒地爾
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R692
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 中英文縮略詞對照表9-10
• 前言10-14
• 實驗裝置與方法14-20
• 一、實驗動物和細胞14-15
• 二、實驗器材與方法15-19
• 三、統(tǒng)計學處理19-20
• 結(jié)果20-25
• 一、CKD抑制PI3K的活性但AKT活性下降更為顯著，且PTEN被激活20-21
• 二、ROCK1在CKD小鼠的骨骼肌中被激活21-22
• 三、ROCK1全身敲除可拮抗CKD導致的肌肉萎縮22-23
• 四、激活的ROCK1通過PTEN抑制AKT的活性23-24
• 五、ROCK1抑制劑法舒地爾可延緩CKD小鼠的肌肉萎縮24-25
• 討論25-28
• 結(jié)論28-29
• 參考文獻29-33
• 綜述 慢性腎臟病與肌肉萎縮33-48
• 參考文獻42-48
• 在讀期間已發(fā)表論文48-49
• 致謝49

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5 江金W，

本文編號：473046