本文關(guān)鍵詞：膀胱癌患者尿液中外泌體及相關(guān)miRNAs的檢測(cè)及臨床意義，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的探討差速超速離心法從膀胱癌患者尿液中提取外泌體(exosome)及相關(guān)微小RNAs(microRNAs,miRNAs)的可行性。對(duì)exosome及miRNAs進(jìn)行鑒定,分析其潛在的臨床價(jià)值,為進(jìn)一步在尿液中尋找膀胱癌診斷標(biāo)記物做前期準(zhǔn)備。方法一、Exosome的差速超速離心提取1.1尿液標(biāo)本的獲取。檢索病例資料數(shù)據(jù)庫(kù),統(tǒng)計(jì)分析既往我院膀胱癌入院患者的數(shù)量及分布情況,說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)標(biāo)本易得。選擇可行的留取膀胱癌患者合格尿液標(biāo)本的方案,制定留取策略,留取標(biāo)本。1.2差速超速離心。劃分非肉眼血尿和肉眼血尿兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組。在留取的100ml尿液中加入保護(hù)劑。4℃下進(jìn)行離心操作。提前預(yù)冷離心機(jī)和轉(zhuǎn)子。2000 g離心10分鐘后去除大的細(xì)胞碎片;再17000 g離心45分鐘,去除較小的碎片和較大的細(xì)胞外囊泡;然后200000 g離心70分鐘,去除上清液;加入PBS重懸再次離心;最后用40μl去離子水溶解,-80℃凍存,或繼續(xù)下一步實(shí)驗(yàn)。二、Exosome的鑒定分析2.1透射電子顯微鏡觀察。取上步中離心提取的樣品10μl,加入去離子水稀釋后在超聲振蕩儀下將exosome分散開(kāi),取10μl稀釋分散后的樣品滴加在超薄碳膜銅網(wǎng)的碳膜面,1分鐘后濾紙從銅網(wǎng)一側(cè)吸去多余的樣品,再滴加5μl多聚甲醛固定液,10分鐘后吸去多余液體;然后滴加5μl PBS溶液,5分鐘,重復(fù)三遍;再滴加5μl戊二醛固定液,10分鐘后吸去多余液體;PBS溶液清洗三遍;最后滴加5μl磷鎢酸染液。1分鐘后,白熾燈下烤干后鏡下觀察。2.2納米微粒追蹤分析(NTA)。開(kāi)機(jī),設(shè)置參數(shù);取3μl離心提取物,加入約0.3 ml水中混勻;將混勻的液體注入,開(kāi)始分析。2.3免疫印跡實(shí)驗(yàn)。BCA法測(cè)定提取的exosome中蛋白濃度。配制所需試劑。將標(biāo)本在95℃下加熱5分鐘變性。然后上樣后進(jìn)行120 V恒壓下電泳。然后350 mA恒流下電轉(zhuǎn)70分鐘。將PVDF膜在5%封閉液中4℃搖晃過(guò)夜封閉。然后一抗室溫孵育2小時(shí),二抗室溫孵育1小時(shí)。顯影觀察目的蛋白的表達(dá)情況。三、miRNA的鑒定分析3.1 miRNA的提取。應(yīng)用miRNA提取試劑盒提取exosome中的miRNA,并測(cè)量其濃度。冷凍真空干燥法純化mi RNA。3.2 qPCR分析。設(shè)置qPCR參數(shù):解鏈溫度94℃,時(shí)間2分鐘;變性溫度為94℃,時(shí)間20秒;退火溫度設(shè)置為62℃,時(shí)間34秒。循環(huán)43次。結(jié)果1、本院膀胱癌入院患者數(shù)量較多,簽訂知情同意書(shū)可提高留取合格尿液標(biāo)本的成功率,為23/25。2、差速超速離心法可穩(wěn)定的從膀胱癌患者尿液中提取外泌體。3、電鏡、NTA和免疫印跡結(jié)果顯示離心提取物中大量外泌體的存在,同時(shí)發(fā)現(xiàn)其中混雜有胞外囊泡。4、通過(guò)qPCR檢測(cè)到健康人尿液和膀胱癌患者尿液中15b-5p等miRNA具有顯著性的差異。結(jié)論1、本研究獲取大量尿液標(biāo)本的可行性高。2、膀胱癌患者尿液離心提取物中含有大量exosome。3、可以從exosome中提取出miRNA。4、通過(guò)差速超速離心法提取膀胱癌患者尿液中exosome及mi RNA可行、可靠。尿液將成為膀胱癌診斷生物標(biāo)記物的良好來(lái)源。
【關(guān)鍵詞】：膀胱癌 尿液 外泌體 微小RNA 鑒定分析
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.14
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明11-14
• 前言14-17
• 研究現(xiàn)狀、成果14-15
• 研究目的、方法15-17
• 一、膀胱癌患者尿液中exosome的超速低溫提取17-31
• 1.1 對(duì)象和方法17-24
• 1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑17-18
• 1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器18-19
• 1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑的配制19-20
• 1.1.4 尿液的留取和保存20-22
• 1.1.5 差速超速離心法提取尿液中exosome22-23
• 1.1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法23-24
• 1.2 結(jié)果24-26
• 1.2.1 本研究平臺(tái)膀胱癌患者尿液標(biāo)本容易獲得24
• 1.2.2 通過(guò)制定患者知情同意書(shū)提高留取合格標(biāo)本的成功率24-25
• 1.2.3 非肉眼血尿組和肉眼血尿組尿液離心效果比較25-26
• 1.3 討論26-30
• 1.4 小結(jié)30-31
• 二、Exosome的鑒定分析31-47
• 2.1 對(duì)象和方法31-38
• 2.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑31-32
• 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器32-33
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑的配制33-35
• 2.1.4 Exosome的透射電鏡觀察35-36
• 2.1.5 NTA技術(shù)檢測(cè)exosome36
• 2.1.6 Exosome特征性蛋白質(zhì)的提取和免疫印跡檢測(cè)36-38
• 2.1.7 統(tǒng)計(jì)分析38
• 2.2 結(jié)果38-41
• 2.2.1 膀胱癌患者尿液中exosome的電鏡鑒定38-39
• 2.2.2 膀胱癌患者尿液中exosome的NTA39-40
• 2.2.3 膀胱癌患者尿液中exosome標(biāo)記蛋白的免疫印跡檢測(cè)40-41
• 2.3 討論41-45
• 2.4 小結(jié)45-47
• 三、Exosome中miRNA的相關(guān)分析47-63
• 3.1 對(duì)象和方法47-53
• 3.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑47-48
• 3.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器48-49
• 3.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑的配制49-50
• 3.1.4 Exosome中miRNA的提取50
• 3.1.5 miRNA濃度的測(cè)定50
• 3.1.6 miRNA的純化和濃縮（冷凍真空干燥法）50-51
• 3.1.7 miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA51
• 3.1.8 普通PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳51-52
• 3.1.9 實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳52-53
• 3.1.10 統(tǒng)計(jì)分析53
• 3.2 結(jié)果53-57
• 3.2.1 不同尿液中提取miRNA53-54
• 3.2.2 冷凍真空法純化和濃縮miRNA54-55
• 3.2.3 qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果55-57
• 3.3 討論57-61
• 3.4 小結(jié)61-63
• 結(jié)論63-64
• 論文創(chuàng)新點(diǎn)64-65
• 參考文獻(xiàn)65-72
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明72-73
• 綜述 尿液exosome及相關(guān)microRNA在膀胱癌診斷中的意義73-87
• 綜述參考文獻(xiàn)80-87
• 致謝87-88
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷88

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