本文關(guān)鍵詞：酸性環(huán)境對慢性腎衰竭大鼠血管鈣化的影響及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease,CKD)發(fā)病率逐年升高,目前成為了世界性難題,研究顯示心血管疾病(Cardiovascular Disease,CVD)成為CKD患者首位死因,而血管鈣化是心血管疾病發(fā)生的獨立危險因素。血管中膜鈣化是CKD患者血管鈣化的主要特征。血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)作為血管中膜的重要組成成分,研究發(fā)現(xiàn),酸性環(huán)境可以抑制血管中膜鈣化,但其具體機制尚不明確。本研究探討酸性環(huán)境對慢性腎衰竭大鼠血管鈣化的影響及可能機制。方法:1實驗分組和模型構(gòu)建1.1以行5/6腎切除術(shù)來構(gòu)建大鼠慢性腎衰竭的模型,再通過飼喂骨化三醇引起大鼠血管鈣化的發(fā)生,飼喂NH4CL構(gòu)建大鼠的慢性代謝性酸中毒的模型。將22只健康雄性SD大鼠,將大鼠隨機分成4組,即假手術(shù)組(sham;n=6)、慢性腎衰竭組(CKD;n=5)、鈣化組(CKD+VC;n=5)和酸干預(yù)組(CKD+VC+AC;n=6)。于大鼠的腹主動脈穿刺采血,血氣分析測定動脈血pH,動脈血用肝素抗凝,離心后,分離血漿,-80℃凍存?zhèn)溆�。取大鼠胸腹主動脈全長,用于組織學(xué)觀察和鈣含量測定。1.2體外細(xì)胞實驗用10m Mβ-甘油磷酸誘導(dǎo)VSMCs鈣化,依據(jù)動物實驗大鼠血氣分析結(jié)果,酸干預(yù)大鼠動脈血氣pH值為7.143±0.163,體外實驗為更好模擬體內(nèi)實驗,選定酸干預(yù)組pH值為7.1。將VSMCs隨機分為4組:(1)正常+pH7.4組(2)高磷+pH7.1組(3)高磷+pH7.4組(4)維拉帕米干預(yù)組。2大鼠標(biāo)本采集與處理5周之后用2%戊巴比妥鈉30mg/kg予大鼠麻醉,腹主動脈穿刺,應(yīng)用血氣分析儀檢測動脈pH、[HCO~(3-)]濃度,同時采血用Unicel Dxc800全自動生化分析儀檢測大鼠血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。摘取胸主動脈全段:上段組織保存于液氮用于鈣含量檢測;下段用10%甲醛固定后石蠟包埋行鈣化染色及runx2和LTCCβ3亞基免疫組織化學(xué)染色。血管von Kossa鈣化染色檢測血管鈣化情況,鈣鹽沉積處被染為黑色。血管鈣含量測定:鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法測定鈣含量,以mg/g為單位。免疫組織化學(xué)法檢測血管runx2和LTCCβ3表達3各組VSMCs目的基因的表達提取細(xì)胞干預(yù)4天后正常+pH7.4組、高磷+pH7.1組、高磷+pH7.4組、維拉帕米干預(yù)組m RNA,測定L型鈣通道(calcium channels,L-type,LTCC)β3亞基和runx2基因的表達。4各組VSMCs目的蛋白的表達Western印跡:L型鈣通道(calcium channels,L-type,LTCC)β3亞基和runx2蛋白的表達。5 VSMCs鈣化情況及ALP的活性測定細(xì)胞鈣含量測定:細(xì)胞培養(yǎng)14天后棄去上清,BCA法測定細(xì)胞蛋白含量,結(jié)果用蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)化鈣含量(mg/g蛋白)。茜素紅鈣化染色:茜素紅(0.1%,pH8.3)染液中37℃溫箱賦育30min,結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):鈣鹽沉積為橘紅色。ALP活性測定:依據(jù)ALP活性試劑盒測定ALP活性,結(jié)果用蛋白質(zhì)校準(zhǔn)ALP活性。6血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度測定在細(xì)胞刺激4天,采用鈣離子探針檢測VSMCs內(nèi)鈣離子濃度。結(jié)果:1體外酸性環(huán)境對高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化的影響細(xì)胞培養(yǎng)14天后,鈣含量結(jié)果與鈣化茜素紅染色一致,與正常+pH7.4組相比,高磷+pH7.4組鈣含量明顯增多(P0.05),鈣鹽沉積較多;與高磷+pH7.4組相比,高磷+pH7.1組細(xì)胞鈣含量明顯減少(P0.05),橘紅色鈣鹽沉積較少。2體外酸性環(huán)境對高磷誘導(dǎo)的VSMCs LTCCβ3亞基的表達和細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流效應(yīng)的影響RT-PCR和western印記結(jié)果顯示,高磷+pH7.4組LTCCβ3亞基m RNA表達和蛋白水平較正常+pH7.4組增加(P0.05);但是高磷+pH7.1組的表達量明顯較高磷+pH7.4組表達減少(P0.05)。血管平滑肌細(xì)胞Fluo-3/AM熒光強度和熒光顯色結(jié)果顯示,與正常+pH7.4組相比,高磷+pH7.4組血管平滑肌細(xì)胞熒光強度增加(P0.05);與高磷+pH7.4組相比,高磷+pH7.1組胞內(nèi)的熒光強度下降(P0.05)。3體外酸性環(huán)境對高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs runx2表達和ALP活性的影響RT-PCR和western印記結(jié)果顯示保持一致,同正常+pH7.4組相比,高磷+pH7.4組runx2表達水平增加(P0.05);與高磷+pH7.4組相比,高磷+pH7.1組表達量明顯減少(P0.05)。ALP活性測定結(jié)果顯示:酸性環(huán)境抑制了ALP活性(P0.05)。維拉帕米阻斷LTCC后,減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強度(P0.05),抑制高磷誘導(dǎo)的runx2表達(P0.05),減少鈣鹽沉積(P0.05)。4酸性環(huán)境對慢性腎衰竭大鼠主動脈鈣化情況比較與假手術(shù)組(n=6)大鼠相比,慢性腎衰竭組(n=5)、鈣化組(n=5)及酸干預(yù)組(n=6)大鼠血肌酐和尿素氮水平均顯著增高(P0.05);與假手術(shù)組、慢性腎衰竭組(n=5)、鈣化組(n=5)分別比較,酸干預(yù)組大鼠動脈血pH和[HCO3-]水平均下降(P0.05)。鈣含量結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比較,慢性腎衰竭組大鼠主動脈鈣含量無明顯增高(2.33±0.42vs2.41±0.41,P0.05),鈣化組大鼠主動脈鈣含量顯著增高(9.66±1.62vs2.41±0.41,P0.05);與鈣化組相比,酸干預(yù)大鼠主動脈鈣含量明顯降低(4.83±0.73vs9.66±1.62,P0.05)。von Kossa染色結(jié)果保持一致。5體內(nèi)酸性環(huán)境對慢性腎衰竭大鼠LTCCβ3亞基和runx2在主動脈的表達的影響免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,假手術(shù)組和慢性腎衰竭組runx2和LTCCβ3亞基免疫組化評分均低于鈣化組(6.20±1.64vs2.16±0.75,6.20±1.64vs3.00±1.00,6.60±2.51vs1.83±0.98,6.60±2.51vs2.60±0.55),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);大鼠體內(nèi)酸性環(huán)境下調(diào)runx2和LTCCβ3亞基的表達(6.20±1.64vs3.83±1.33,6.60±2.51vs3.00±1.45,P0.05)。結(jié)論:酸性環(huán)境可以抑制VSMCs的鈣化,其機制可能是酸性環(huán)境通過下調(diào)L型鈣通道β3亞基表達,阻滯鈣離子內(nèi)流,來起到抗VSMCs成骨成軟骨樣表型轉(zhuǎn)化的作用。
【關(guān)鍵詞】：血管平滑肌細(xì)胞 β-甘油磷酸鹽 酸性環(huán)境 鈣化 runx2 LTCCβ3亞基 慢性腎衰竭
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R692.5
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-15
• 材料與方法15-23
• 結(jié)果23-25
• 附圖25-28
• 附表28-29
• 討論29-32
• 結(jié)論32-33
• 參考文獻33-35
• 綜述 鈣信號通路對血管鈣化影響的研究進展35-42
• 參考文獻40-42
• 致謝42-43
• 個人簡歷43

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 白亞玲;徐金升;錢sネ，

本文編號：438589