本文關(guān)鍵詞：短肽B04對(duì)前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白ATP5B特異性抑制作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的癌癥,當(dāng)發(fā)生局部侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移后將很難治療。因此,闡明新的前列腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制以及識(shí)別高轉(zhuǎn)移潛能前列腺癌的潛在診療靶點(diǎn)是十分必要的,而迄今為止與前列腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的特異性蛋白尚未見(jiàn)報(bào)道。因此在本實(shí)驗(yàn)中,我們旨在發(fā)現(xiàn)和鑒定前列腺癌高轉(zhuǎn)移相關(guān)膜蛋白。在本課題組前期實(shí)驗(yàn)中,我們選用前列腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系PC-3M細(xì)胞、前列腺癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系PC-3細(xì)胞和正常前列腺上皮細(xì)胞通過(guò)噬菌體七肽庫(kù)進(jìn)行差減篩選,得到了只與PC-3M特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)移相關(guān)短肽B04,并且發(fā)現(xiàn)短肽B04能夠有效抑制PC-3M細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。隨后,通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)等方法檢測(cè)到了短肽B04的受體蛋白為PC-3M細(xì)胞膜上的ATP5B。本研究旨在驗(yàn)證ATP5B是否在PC-3M細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)以及B04能否通過(guò)特異性抑制PC-3M細(xì)胞膜上表達(dá)的ATP5B來(lái)抑制其侵襲能力,并進(jìn)一步檢測(cè)短肽B04對(duì)HUVEC成管能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.ATP5B在高級(jí)別前列腺癌組織中的表達(dá)及定位采用免疫熒光組織化學(xué)雙重染色的方法對(duì)ATP5B及E-Cadherin兩種蛋白在高級(jí)別前列腺癌組織(臨床分期IV期)中進(jìn)行雙重染色,E-Cadherin為上皮組織中細(xì)胞膜上表達(dá)的鈣粘蛋白,主要作用是對(duì)ATP5B的表達(dá)進(jìn)行共定位檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:ATP5B在高級(jí)別前列腺癌組織的細(xì)胞漿及細(xì)胞膜上均表達(dá)陽(yáng)性。2.ATP5B在前列腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系PC-3M細(xì)胞及前列腺癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系PC-3中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)雙重染色方法對(duì)ATP5B及E-Cadherin兩種蛋白在前列腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系PC-3M細(xì)胞和前列腺癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系PC-3細(xì)胞中進(jìn)行雙重染色。結(jié)果顯示:ATP5B在PC3M的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜中均有表達(dá),而在PC3細(xì)胞中,ATP5B的陽(yáng)性顆粒只存在于其細(xì)胞漿中;進(jìn)而采用免疫電鏡技術(shù)對(duì)ATP5B在PC-3M和PC-3兩種細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行精確的亞細(xì)胞定位。電鏡結(jié)果顯示:在PC-3M細(xì)胞膜上可見(jiàn)到陽(yáng)性膠體金顆粒,但在PC-3細(xì)胞膜上未見(jiàn)到膠體金顆粒。隨后進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)、Western blot等方法檢測(cè)ATP5B在PC-3M和PC-3細(xì)胞膜上的表達(dá)量。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:ATP5B在PC-3M和PC-3細(xì)胞的細(xì)胞膜上陽(yáng)性表達(dá)的百分比及熒光強(qiáng)度分別為61.68%±3.94%vs20.10%±1.79%,53.87±5.14vs17.46±0.31,且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,兩種細(xì)胞細(xì)胞膜上ATP5B陽(yáng)性表達(dá)的百分比及熒光強(qiáng)度比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示:PC-3M和PC-3細(xì)胞膜蛋白中ATP5B蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度的相對(duì)值分別為0.428±0.075和0.161±0.065,且兩組間相對(duì)值比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。以上結(jié)果表明ATP5B在PC-3M細(xì)胞膜上有表達(dá),且在PC-3M細(xì)胞膜上的表達(dá)量明顯高于PC-3細(xì)胞。3.短肽B04與PC-3M細(xì)胞膜上的ATP5B特異性結(jié)合采用流式細(xì)胞術(shù)、real time PCR和Western blot等方法進(jìn)一步研究短肽B04與PC-3M細(xì)胞膜上的ATP5B能否特異性結(jié)合。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:用短肽B04預(yù)孵育PC-3M細(xì)胞后,PC-3M細(xì)胞膜上ATP5B陽(yáng)性表達(dá)的百分比為17.23%±1.13%,明顯低于PC-3M空白組ATP5B陽(yáng)性表達(dá)的百分比61.25%±2.56%,且兩組之間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。real time PCR結(jié)果顯示:用短肽B04預(yù)孵育PC-3M細(xì)胞后,PC-3M細(xì)胞中的ATP5Bm RNA與內(nèi)參GAPDH m RNA相對(duì)值由1.00±0.03升高至1.34±0.06,且兩者之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:用過(guò)量的短肽B04與含有PC-3M細(xì)胞總蛋白的PVDF膜預(yù)孵育后,再加入ATP5B的特異性抗體孵育后無(wú)條帶顯示。以上結(jié)果說(shuō)明短肽B04與PC-3M細(xì)胞膜上的ATP5B特異性結(jié)合。4.B04通過(guò)封閉PC-3M細(xì)胞膜上表達(dá)的ATP5B降低PC-3M細(xì)胞的侵襲能力采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與短肽B04共孵育對(duì)PC-3M細(xì)胞侵襲能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:用短肽B04封閉PC-3M細(xì)胞表面的ATP5B后,PC-3M細(xì)胞發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)為7.83±1.31,明顯低于PC-3M空白組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)45.67±4.32,且兩組間發(fā)生侵襲細(xì)胞數(shù)的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.短肽B04對(duì)HUVEC成管能力的影響采用內(nèi)皮細(xì)胞管型形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)短肽B04對(duì)HUVEC小管形成能力的影響;實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:短肽B04與HUVEC共孵育后,HUVEC的成管能力明顯下降。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了ATP5B在前列腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系PC-3M細(xì)胞膜上高表達(dá),轉(zhuǎn)移相關(guān)短肽B04通過(guò)特異性抑制膜上的ATP5B的功能來(lái)抑制PC-3M細(xì)胞的侵襲能力和HUVEC細(xì)胞的成管能力,以上結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明了前列腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系PC-3M細(xì)胞膜上高表達(dá)ATP5B可能與促進(jìn)前列腺癌的高轉(zhuǎn)移能力相關(guān),提示了ATP5B可能為高轉(zhuǎn)移腫瘤的潛在生物學(xué)標(biāo)志和治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：前列腺癌 ATP5B 轉(zhuǎn)移 膜蛋白
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.25
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 第1章 緒論14-19
• 1.1 腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移14-15
• 1.2 ATP5B的研究進(jìn)展15-18
• 1.2.1 ATP5B亞基的異位表達(dá)15-16
• 1.2.2 異位ATP5B與腫瘤16-17
• 1.2.3 異位ATP5B與血管新生17-18
• 1.3 本研究擬解決的問(wèn)題及項(xiàng)目創(chuàng)新點(diǎn)18-19
• 第2章 材料和方法19-30
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19-22
• 2.1.1 主要試劑19-20
• 2.1.2 主要儀器20-21
• 2.1.3 主要溶液21-22
• 2.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)條件及來(lái)源22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-30
• 2.2.1 免疫熒光組織化學(xué)雙重染色22-23
• 2.2.2 細(xì)胞免疫熒光染色23-24
• 2.2.3 Western blot24-26
• 2.2.4 細(xì)胞免疫電鏡染色26
• 2.2.5 流式細(xì)胞術(shù)26-27
• 2.2.6 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR27-28
• 2.2.7 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)28
• 2.2.8 HUVEC成管實(shí)驗(yàn)28-29
• 2.2.9 數(shù)據(jù)處理29-30
• 第3章 結(jié)果30-41
• 3.1 ATP5B在高級(jí)別前列腺癌組織中的表達(dá)及定位30-31
• 3.2 ATP5B在前列腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系PC-3M細(xì)胞及前列腺癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系PC-3 中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位31-34
• 3.2.1 細(xì)胞免疫熒光雙染檢測(cè)ATP5B在PC-3M和PC-3 兩種細(xì)胞中的表達(dá)31-32
• 3.2.2 免疫電鏡技術(shù)對(duì)ATP5B在PC-3M和PC-3 兩種細(xì)胞中表達(dá)的亞細(xì)胞定位32
• 3.2.3 Western blot對(duì)ATP5B在PC-3M和PC-3 細(xì)胞膜中表達(dá)的半定量檢測(cè)32-34
• 3.2.4 流式細(xì)胞術(shù)對(duì)ATP5B在PC-3M和PC-3 細(xì)胞膜中表達(dá)量的檢測(cè)34
• 3.3 短肽B04與PC-3M細(xì)胞膜上的ATP5B特異性結(jié)合34-38
• 3.3.1 短肽B04與PC-3M細(xì)胞膜上的蛋白結(jié)合34-35
• 3.3.2 與短肽B04孵育后，PC-3M細(xì)胞膜上ATP5B的陽(yáng)性率明顯下降35-37
• 3.3.3 B04與ATP5B特異性結(jié)合37
• 3.3.4 與短肽B04孵育后，PC-3M細(xì)胞中ATP5B的m RNA升高37-38
• 3.4 B04通過(guò)封閉PC-3M細(xì)胞膜上表達(dá)的ATP5B降低PC-3M細(xì)胞的侵襲能力38-39
• 3.5 短肽B04對(duì)HUVEC成管能力的影響39-41
• 第4章 討論41-45
• 4.1 噬菌體展示肽庫(kù)在識(shí)別腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白中的適用性41-42
• 4.2 ATP5B的異位表達(dá)42
• 4.3 異位表達(dá)的ATP5B的功能42-43
• 4.4 異位ATP5B調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為可能的信號(hào)通路43-45
• 第5章 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-51
• 作者簡(jiǎn)介51-52
• 致謝52

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