目的:觀察雷帕霉素對葡萄糖誘導(dǎo)SD大鼠陰莖海綿體平滑細(xì)胞（CCSMC）自噬與凋亡的影響。方法:原代分離純化鑒定CCSMC后分別用5.6、10、20、30、40 mmol/L葡萄糖處理CCSMC 48 h,mCherry-GFP-LC3B雙熒光腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測自噬流情況;Western印跡及PCR檢測自噬相關(guān)指標(biāo)、自噬相關(guān)基因5（ATG5）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）、P62、Beclin-1的蛋白和mRNA水平的變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度葡萄糖處理后細(xì)胞凋亡情況,然后再檢測用600 nmol/L雷帕霉素預(yù)處理2 h再用40 mmol/L葡萄糖處理CCSMC 48 h后自噬相關(guān)指標(biāo)LC3、Beclin1、P62的蛋白和mRNA水平的變化以及細(xì)胞凋亡的變化情況。結(jié)果:mCherry-GFP-LC3B雙熒光腺病毒轉(zhuǎn)染及PCR、Western印跡均提示在不同濃度葡萄糖處理后均發(fā)生了自噬現(xiàn)象,隨著葡萄糖濃度升高,在10 mmol/L葡萄糖組自噬現(xiàn)象最強(qiáng)（P<0.05）,之后隨著葡萄糖濃度升高自噬現(xiàn)象逐漸減弱（P<0.05）;流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)相對于5.6 mmol/L葡萄糖組... 

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【部分圖文】：

CCSMC的鑒定

mCherry-GFP-LC3雙熒光腺病毒轉(zhuǎn)染在非自噬情況下以彌散的黃色熒光存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),在自噬情況下mCherry-GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上,呈現(xiàn)黃色熒光斑點(diǎn),而當(dāng)自噬與溶酶體融合形成自噬溶酶體后,因GFP在酸性環(huán)境下發(fā)生淬滅,而呈紅色斑點(diǎn)。共聚焦熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)與5.6 mmol/L葡萄糖組相比,10 mmol/L葡萄糖組細(xì)胞中自噬小體與自噬溶酶體均增加(P<0.01),而與10 mmol/L組相比,20 mmol/L葡萄糖組胞中自噬小體與自噬溶酶體若有下降,而30、40 mmol/L葡萄糖組細(xì)胞中自噬小體與自噬溶酶體呈顯著下降減少(P<0.01)。見圖2。2.3 Western印跡檢測不同濃度葡萄糖干預(yù)CCSMC后自噬相關(guān)指標(biāo)ATG5、Beclin1、LC3、P62蛋白水平變化情況

PCR檢測提示與40 mmo/L葡萄糖組相比,雷帕霉素預(yù)處理組Beclin1 mRNA表達(dá)量明顯增加(P<0.01)P62的mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。見圖6。圖4 雷帕霉素預(yù)處理CCSMC后自噬相關(guān)蛋白P62、Beclin1、LC3的變化

【參考文獻(xiàn)】：
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