目的：構(gòu)建靶向人睪丸基因TDRG1的shRNA重組質(zhì)粒表達(dá)載體,并研究其在人惡性畸胎瘤細(xì)胞（NTERA-2）的表達(dá)。篩選出高效且特異性抑制TDRG1基因表達(dá)的重組質(zhì)粒表達(dá)載體,為下一步研究TDRG1基因?qū)ΣG丸腫瘤生物學(xué)行為的作用奠定基礎(chǔ)。方法：設(shè)計(jì)合成有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)靶位TDRG1基因的寡核苷酸,經(jīng)退火成雙鏈,克隆至載體pGPU6/GFP/Neo中,構(gòu)建了TDRG1-shRNA表達(dá)載體,得到重組質(zhì)粒TDRG1-shRNA486, TDRG1-shRNA738, TDRG1-shRNA921和一個(gè)陰性對(duì)照,轉(zhuǎn)化入JM109大腸桿菌,抽提質(zhì)粒,進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定,分別使用LipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒shRNA至人惡性畸胎瘤細(xì)胞中,再應(yīng)用Real Time-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后人惡性畸胎瘤細(xì)胞TDRG1mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：酶切結(jié)果表明,所有質(zhì)粒均為陽(yáng)性重組質(zhì)粒,經(jīng)基因測(cè)序證實(shí),插入的DNA片段的序列與設(shè)計(jì)序列完全一致。同時(shí)篩選到轉(zhuǎn)染TDRG1-shRNA486的人惡性畸胎瘤細(xì)胞TDRG1基因的mRNA表達(dá)水平明顯抑制（p<0.01）,并對(duì)TDRG1基因mRNA... 

【文章來源】：中南大學(xué)湖南省211工程院校985工程院校教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：54 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
1 前言
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 材料與試劑
        2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 寡核苷酸的合成
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)分組
        2.2.3 shRNA模板的退火
        2.2.4 pGPU6/GFP/Neo載體的線性化
        2.2.5 pGPU6/GFP/Neo-shRNA載體的構(gòu)建
        2.2.6 構(gòu)建質(zhì)粒酶切鑒定和DNA序列測(cè)序鑒定
        2.2.7 shRNA轉(zhuǎn)染篩選有效序列
        2.2.8 應(yīng)用Real time-PCR檢測(cè)各組TDRG1mRNA表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)
        2.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
3 結(jié)果
    3.1 重組表達(dá)載體的酶切鑒定
    3.2 熒光顯微鏡結(jié)果
    3.3 Real time-PCR檢測(cè)結(jié)果
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀學(xué)位期間主要的研究成果目錄
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]組織芯片技術(shù)檢測(cè)人睪丸基因TDRG1在睪丸腫瘤組織中的表達(dá)[J]. 陳厚仰,文甲明,肖小旺,李東杰,郭小亮,龍智,戴英波,湯育新.  中華男科學(xué)雜志. 2010(10)
[2]人睪丸特異表達(dá)基因TDRG1單克隆抗體的制備及鑒定[J]. 文甲明,蔣先鎮(zhèn),湯育新,陽(yáng)建福,陳厚仰,劉志中.  中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2010(03)
[3]睪丸腫瘤流行病學(xué)研究進(jìn)展[J]. 張宏艷,劉端祺.  解放軍醫(yī)學(xué)雜志. 2007(03)
[4]一個(gè)新的人類睪丸特異性基因-TDRG1的cDNA克隆[J]. 蔣先鎮(zhèn),陽(yáng)建福,湯育新,譚小軍,李輝,張向陽(yáng),吳畏.  中國(guó)男科學(xué)雜志. 2006(07)
[5]PDE5抑制劑治療ED研究進(jìn)展[J]. 盧永寧,陳斌.  中華男科學(xué)雜志. 2005(07)



本文編號(hào)：3624436