本文關鍵詞：量子點免疫熒光雙色標記檢測醛糖還原酶和Toll樣受體4在細胞模型及糖尿病大鼠腎臟組織中的表達，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是嚴重危害人類健康的主要慢性疾病之一,糖尿病腎病(Diabetic nephropathy, DN)約占糖尿病人群的1/3,發(fā)病機制復雜,可能涉及到多種因素,包括醛糖還原酶(Aldose reductase, AR)和Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)。AR是糖代謝多元醇通路中的關鍵限速酶。AR過度表達不僅在糖尿病并發(fā)癥中發(fā)揮著重要作用,還可能參與體內(nèi)多種信號通路的調(diào)節(jié),尤其是炎癥反應。多項研究表明DN不只是代謝相關性疾病,亦是免疫及炎癥相關性疾病,炎癥反應可導致DN發(fā)生腎小管損傷。TLR4通過識別和結(jié)合病原相關分子參與細胞跨膜信號轉(zhuǎn)導通路,從而介導機體炎癥反應,被認為是哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的介導炎癥反應的關鍵跨膜蛋白。特異性蛋白標志物的有效檢測對于疾病的診斷和治療有重要價值。常用的病理學檢測手段包括免疫組織化學法(Immunohistochemistry, IHC)和免疫熒光染色法。但這兩種方法不易實現(xiàn)同一組織切片多種蛋白的同時檢測。量子點(Quantum dots,QDs)是一種新型的納米熒光材料,具著優(yōu)良的光學特性,是生物標志物檢測,尤其是多種標志物同時檢測的理想熒光探針。目的：研究AR和TLR4在細胞模型及糖尿病大鼠模型中的表達和意義,為糖尿病腎病的診斷和治療提供新思路。并利用量子點免疫熒光雙色標記同時檢測AR和TLR4在腎組織中的表達,為探討二者的關系及量子點標記技術在疾病診斷及治療中的價值奠定基礎。方法：1、轉(zhuǎn)染含人醛糖還原酶基因的質(zhì)粒,構建AR高表達的細胞模型;2、制備及檢測QD-anti-AR、QD-anti-TLR4復合物熒光探針;3、免疫細胞化學法和量子點免疫熒光標記法檢測及定位COS-7細胞模型中AR的表達;4、糖尿病大鼠腎組織的病理學HE染色;5、傳統(tǒng)IHC和量子點免疫熒光標記法檢測AR和TLR4在糖尿病大鼠腎組織中的表達;6、量子點免疫熒光雙色標記法同時檢測糖尿病大鼠腎組織中AR和TLR4的表達。結(jié)果：1、免疫細胞化學法和熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況均證實AR高表達的COS-7細胞模型構建成功,并利用量子點免疫熒光標記法準確定位了AR在細胞中的表達部位,位于細胞漿和細胞膜;2、大鼠腎組織HE染色顯示：糖尿病大鼠腎小球體積明顯增大,腎小管上皮細胞出現(xiàn)空泡變性,提示該組大鼠出現(xiàn)糖尿病腎病早期病變；3、利用傳統(tǒng)IHC和量子點免疫熒光標記法檢測到在糖尿病大鼠腎組織中AR表達上調(diào),其表達部位為腎小球毛細血管和腎間質(zhì)血管；4、利用傳統(tǒng)IHC和量子點免疫熒光標記法檢測到在糖尿病大鼠腎小管TLR4表達上調(diào),其中在發(fā)生空泡變性的腎小管表達更明顯;5、運用量子點免疫熒光雙色標記首次同時檢測到AR和TLR4在糖尿病大鼠腎組織的高表達,兩種蛋白的表達部位與單獨檢測的結(jié)果一致；6、通過蛋白偶聯(lián)劑EDC分別將羧基修飾QDs與AR抗體和TLR4抗體成功偶聯(lián),并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測偶聯(lián)產(chǎn)物,得到QDs與抗體的最佳偶聯(lián)比：7、在對細胞和組織AR和TLR4蛋白的檢測中,優(yōu)化的QDs免疫熒光標記技術包括QDs與抗體的復合物探針及親和素化的量子點,均顯示出良好的特異性和敏感性,其實驗步驟方便快捷,非特異性著色較傳統(tǒng)IHC少。結(jié)論：1、成功構建了AR高表達的COS-7細胞模型,并準確定位了AR的表達部位,為靶向性篩選ARIs奠定了基礎;2、通過IHC直觀的觀察到AR在糖尿病大鼠腎組織的分布情況,表明AR參與DN的發(fā)病進程,且有可能作為DN發(fā)生發(fā)展的監(jiān)測指標;3、TLR4在糖尿病大鼠發(fā)生空泡變性的腎小管中高表達,表明TLR4通過炎癥反應介導DN的發(fā)生發(fā)展;4、首次運用量子點免疫熒光雙色標記同時檢測到AR和TLR4在糖尿病大鼠腎組織的高表達,提示AR和TLR4蛋白共同參與了DN的發(fā)病過程,兩者可能在介導炎癥反應方面存在一定聯(lián)系；5、優(yōu)化的QDs免疫熒光標記技術顯示出良好的特異性和敏感性,在多色標記方面是對傳統(tǒng)IHC方法的有益補充。為探討多種蛋白在疾病發(fā)生發(fā)展機制中的相互關系提供了有力依據(jù)。
【關鍵詞】：糖尿病腎病 醛糖還原酶 Toll樣受體4 量子點 免疫熒光標記
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2;R692.9
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-16
• 第一部分 醛糖還原酶在真核細胞模型的表達及意義16-28
• 材料與方法17-23
• 結(jié)果23-26
• 討論26-28
• 第二部分 量子點免疫熒光雙色標記糖尿病大鼠腎臟組織中表達的醛糖還原酶和Toll樣受體428-44
• 材料與方法29-36
• 結(jié)果36-41
• 討論41-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻45-49
• 文獻綜述 糖尿病腎病的發(fā)病機制與靶向治療的研究進展49-59
• 參考文獻54-59
• 攻讀學位期間發(fā)表論文59-60
• 致謝60-61

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 谷娟;嚴謹;吳衛(wèi)華;黃琪;歐陽冬生;;醛糖還原酶的研究進展[J];中南大學學報(醫(yī)學版);2010年04期

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  本文關鍵詞：量子點免疫熒光雙色標記檢測醛糖還原酶和Toll樣受體4在細胞模型及糖尿病大鼠腎臟組織中的表達，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：360120