本文關(guān)鍵詞：量子點(diǎn)免疫熒光雙色標(biāo)記檢測(cè)醛糖還原酶和Toll樣受體4在細(xì)胞模型及糖尿病大鼠腎臟組織中的表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的主要慢性疾病之一,糖尿病腎病(Diabetic nephropathy, DN)約占糖尿病人群的1/3,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,可能涉及到多種因素,包括醛糖還原酶(Aldose reductase, AR)和Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)。AR是糖代謝多元醇通路中的關(guān)鍵限速酶。AR過(guò)度表達(dá)不僅在糖尿病并發(fā)癥中發(fā)揮著重要作用,還可能參與體內(nèi)多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié),尤其是炎癥反應(yīng)。多項(xiàng)研究表明DN不只是代謝相關(guān)性疾病,亦是免疫及炎癥相關(guān)性疾病,炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致DN發(fā)生腎小管損傷。TLR4通過(guò)識(shí)別和結(jié)合病原相關(guān)分子參與細(xì)胞跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng),被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵跨膜蛋白。特異性蛋白標(biāo)志物的有效檢測(cè)對(duì)于疾病的診斷和治療有重要價(jià)值。常用的病理學(xué)檢測(cè)手段包括免疫組織化學(xué)法(Immunohistochemistry, IHC)和免疫熒光染色法。但這兩種方法不易實(shí)現(xiàn)同一組織切片多種蛋白的同時(shí)檢測(cè)。量子點(diǎn)(Quantum dots,QDs)是一種新型的納米熒光材料,具著優(yōu)良的光學(xué)特性,是生物標(biāo)志物檢測(cè),尤其是多種標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)的理想熒光探針。目的：研究AR和TLR4在細(xì)胞模型及糖尿病大鼠模型中的表達(dá)和意義,為糖尿病腎病的診斷和治療提供新思路。并利用量子點(diǎn)免疫熒光雙色標(biāo)記同時(shí)檢測(cè)AR和TLR4在腎組織中的表達(dá),為探討二者的關(guān)系及量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)在疾病診斷及治療中的價(jià)值奠定基礎(chǔ)。方法：1、轉(zhuǎn)染含人醛糖還原酶基因的質(zhì)粒,構(gòu)建AR高表達(dá)的細(xì)胞模型;2、制備及檢測(cè)QD-anti-AR、QD-anti-TLR4復(fù)合物熒光探針;3、免疫細(xì)胞化學(xué)法和量子點(diǎn)免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)及定位COS-7細(xì)胞模型中AR的表達(dá);4、糖尿病大鼠腎組織的病理學(xué)HE染色;5、傳統(tǒng)IHC和量子點(diǎn)免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)AR和TLR4在糖尿病大鼠腎組織中的表達(dá);6、量子點(diǎn)免疫熒光雙色標(biāo)記法同時(shí)檢測(cè)糖尿病大鼠腎組織中AR和TLR4的表達(dá)。結(jié)果：1、免疫細(xì)胞化學(xué)法和熒光顯微鏡觀(guān)察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況均證實(shí)AR高表達(dá)的COS-7細(xì)胞模型構(gòu)建成功,并利用量子點(diǎn)免疫熒光標(biāo)記法準(zhǔn)確定位了AR在細(xì)胞中的表達(dá)部位,位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜;2、大鼠腎組織HE染色顯示：糖尿病大鼠腎小球體積明顯增大,腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性,提示該組大鼠出現(xiàn)糖尿病腎病早期病變；3、利用傳統(tǒng)IHC和量子點(diǎn)免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)到在糖尿病大鼠腎組織中AR表達(dá)上調(diào),其表達(dá)部位為腎小球毛細(xì)血管和腎間質(zhì)血管；4、利用傳統(tǒng)IHC和量子點(diǎn)免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)到在糖尿病大鼠腎小管TLR4表達(dá)上調(diào),其中在發(fā)生空泡變性的腎小管表達(dá)更明顯;5、運(yùn)用量子點(diǎn)免疫熒光雙色標(biāo)記首次同時(shí)檢測(cè)到AR和TLR4在糖尿病大鼠腎組織的高表達(dá),兩種蛋白的表達(dá)部位與單獨(dú)檢測(cè)的結(jié)果一致；6、通過(guò)蛋白偶聯(lián)劑EDC分別將羧基修飾QDs與AR抗體和TLR4抗體成功偶聯(lián),并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)偶聯(lián)產(chǎn)物,得到QDs與抗體的最佳偶聯(lián)比：7、在對(duì)細(xì)胞和組織AR和TLR4蛋白的檢測(cè)中,優(yōu)化的QDs免疫熒光標(biāo)記技術(shù)包括QDs與抗體的復(fù)合物探針及親和素化的量子點(diǎn),均顯示出良好的特異性和敏感性,其實(shí)驗(yàn)步驟方便快捷,非特異性著色較傳統(tǒng)IHC少。結(jié)論：1、成功構(gòu)建了AR高表達(dá)的COS-7細(xì)胞模型,并準(zhǔn)確定位了AR的表達(dá)部位,為靶向性篩選ARIs奠定了基礎(chǔ);2、通過(guò)IHC直觀(guān)的觀(guān)察到AR在糖尿病大鼠腎組織的分布情況,表明AR參與DN的發(fā)病進(jìn)程,且有可能作為DN發(fā)生發(fā)展的監(jiān)測(cè)指標(biāo);3、TLR4在糖尿病大鼠發(fā)生空泡變性的腎小管中高表達(dá),表明TLR4通過(guò)炎癥反應(yīng)介導(dǎo)DN的發(fā)生發(fā)展;4、首次運(yùn)用量子點(diǎn)免疫熒光雙色標(biāo)記同時(shí)檢測(cè)到AR和TLR4在糖尿病大鼠腎組織的高表達(dá),提示AR和TLR4蛋白共同參與了DN的發(fā)病過(guò)程,兩者可能在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)方面存在一定聯(lián)系；5、優(yōu)化的QDs免疫熒光標(biāo)記技術(shù)顯示出良好的特異性和敏感性,在多色標(biāo)記方面是對(duì)傳統(tǒng)IHC方法的有益補(bǔ)充。為探討多種蛋白在疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的相互關(guān)系提供了有力依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：糖尿病腎病 醛糖還原酶 Toll樣受體4 量子點(diǎn) 免疫熒光標(biāo)記
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R587.2;R692.9
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-16
• 第一部分 醛糖還原酶在真核細(xì)胞模型的表達(dá)及意義16-28
• 材料與方法17-23
• 結(jié)果23-26
• 討論26-28
• 第二部分 量子點(diǎn)免疫熒光雙色標(biāo)記糖尿病大鼠腎臟組織中表達(dá)的醛糖還原酶和Toll樣受體428-44
• 材料與方法29-36
• 結(jié)果36-41
• 討論41-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 文獻(xiàn)綜述 糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制與靶向治療的研究進(jìn)展49-59
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文59-60
• 致謝60-61

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 谷娟;嚴(yán)謹(jǐn);吳衛(wèi)華;黃琪;歐陽(yáng)冬生;;醛糖還原酶的研究進(jìn)展[J];中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年04期

2 張志華,葉玲,劉建偉,劉靜;熒光法動(dòng)態(tài)觀(guān)察糖尿病大鼠紅細(xì)胞醛糖還原酶活性[J];中國(guó)老年學(xué)雜志;2005年04期

3 李雪峰;李艷穎;賈文紅;馬志強(qiáng);李忍萍;;α-硫辛酸治療43例Ⅲ期糖尿病腎病患者療效分析[J];中國(guó)慢性病預(yù)防與控制;2011年05期

4 吳茜;陳亨業(yè);胡貝;呂哲娟;謝筆鈞;孫智達(dá);;晚期糖基化終末產(chǎn)物的抑制機(jī)理及抑制劑的研究進(jìn)展[J];中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥;2012年11期

5 陳修平;石京山;;HPLC-熒光法測(cè)定醛糖還原酶的活性[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2012年10期

  本文關(guān)鍵詞：量子點(diǎn)免疫熒光雙色標(biāo)記檢測(cè)醛糖還原酶和Toll樣受體4在細(xì)胞模型及糖尿病大鼠腎臟組織中的表達(dá)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：360120