本文關(guān)鍵詞：PRP睪丸過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：實驗?zāi)康模篜roliferin related protein(PRP)是泌乳素家族成員,以往研究結(jié)果顯示PRP僅表達(dá)于雌性,且高表達(dá)于妊娠后期的胎盤組織。我們課題組在前期實驗中發(fā)現(xiàn)PRP也表達(dá)于雄性睪丸Leydig細(xì)胞,然而PRP在雄性生殖系統(tǒng)中的體內(nèi)功能尚待進(jìn)一步研究。PRP基因體外研究表明：PRP表達(dá)定位于睪丸Leydig細(xì)胞,間接參與睪酮產(chǎn)生,抑制細(xì)胞增殖,表明PRP與生殖功能有關(guān)；PRP表達(dá)量隨年齡的增加而增加,具有延緩衰老和改善生殖功能效應(yīng)的人參皂甙可顯著下調(diào)老年組大鼠PRP表達(dá)量,表明PRP在生殖衰老中發(fā)揮著某種效應(yīng)。為此,本研究擬通過建立PRP睪丸過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠,為深入研究PRP的體內(nèi)功能奠定基礎(chǔ)。實驗方法：1.轉(zhuǎn)基因pEGFP-PRP載體構(gòu)建運用分子克隆技術(shù)制備pEGFP-PRP載體。啟動子LHR以C57小鼠基因組為模板、目的基因PRP以C57小鼠cDNA為模板、SV40以實驗室載體以為模板；將構(gòu)建好的載體進(jìn)行酶切鑒定,測序,純化后備用。在PRP基因前引入Flag標(biāo)簽,便于鑒別外源PRP基因表達(dá)情況。2.顯微注射法制備PRP過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠準(zhǔn)備好C57假孕母鼠、受精卵供體母鼠和C57種公鼠、C57結(jié)扎公鼠,運用原核顯微注射的方法將pEGFP-PRP質(zhì)粒注射入受精卵卵周隙內(nèi),選取顯微注射后狀態(tài)良好的受精卵將其移植入C57假孕母鼠輸卵管內(nèi),等待其產(chǎn)仔鼠。3.PRP過表達(dá)轉(zhuǎn)基因首建鼠的篩選與鑒定運用PCR結(jié)合產(chǎn)物測序方法篩選鑒定外源基因PRP在后代轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的整合情況,以獲得PRP過表達(dá)轉(zhuǎn)基因首建鼠。4.PRP過表達(dá)轉(zhuǎn)基因鼠繁殖與PRP表達(dá)情況檢測分別將轉(zhuǎn)基因首建鼠與C57野生型鼠合籠交配,獲得F1代后,對轉(zhuǎn)基因陽性雄性小鼠與同窩陰性雄性小鼠進(jìn)行檢測。運用PCR法檢測PRP的表達(dá)量；運用免疫組化法檢測PRP的表達(dá)定位情況；ELISA檢測睪酮。實驗結(jié)果：1.成功構(gòu)建轉(zhuǎn)基因pEGFP-PRP載體。2.通過原核顯微注射的方法成功將載體pEGFP-PRP注入小鼠受精卵內(nèi),獲得3只小鼠PRP雄性轉(zhuǎn)基因首建鼠。3.免疫組化顯示外源基因外源PRP特異表達(dá)于睪丸Leydig細(xì)胞,心、腦、肝、腎、脾組織均無表達(dá),Western blot檢測顯示轉(zhuǎn)基因小鼠睪丸PRP表達(dá)明顯高于對照組。4.與對照組相比,PRP轉(zhuǎn)基因小鼠的血清睪酮水平明顯降低。實驗結(jié)論：成功建立了PRP過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型,為深入研究PRP體內(nèi)功能奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：PRP 過表達(dá) 轉(zhuǎn)基因小鼠
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R-332;R698.2
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-15
• 第一部分 PRP睪丸過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備15-37
• 1 實驗材料15-16
• 1.1 主要試劑15
• 1.2 實驗動物15
• 1.3 儀器與設(shè)備15-16
• 2 實驗方法16-29
• 2.1 載體構(gòu)建16-17
• 2.2 目的片段的獲取17-19
• 2.3 融合片段的獲取19-21
• 2.4 EGFP片段的獲取21-22
• 2.5 18T-EGFP載體構(gòu)建22-25
• 2.6 pEGFP-PRP載體構(gòu)建25-27
• 2.7 顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠27-29
• 3 實驗結(jié)果29-35
• 3.1 目的片段的獲取結(jié)果29-30
• 3.2 融合片段的獲取結(jié)果30
• 3.3 EGFP片段的獲取結(jié)果30-31
• 3.4 18T-EGFP載體構(gòu)建結(jié)果31-32
• 3.5 pEGFP-PRP載體的構(gòu)建結(jié)果32-33
• 3.6 測序結(jié)果33-34
• 3.7 顯微注射結(jié)果34-35
• 4 討論35-36
• 5 小結(jié)36-37
• 第二部分 PRP過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖與PRP表達(dá)情況檢測37-50
• 1 實驗材料37-38
• 1.1 實驗動物37
• 1.2 主要試劑37-38
• 1.3 主要設(shè)備38
• 2 實驗方法38-45
• 2.1 PCR法鑒定篩選PRP過表達(dá)小鼠38-40
• 2.2 PRP轉(zhuǎn)基因小鼠的傳代40
• 2.3 PRP轉(zhuǎn)基因在睪丸中免疫組化檢測40-42
• 2.4 外源PRP基因在睪丸中Western-blotting檢測42-44
• 2.5 ELISA檢測血清睪酮含量44-45
• 3 實驗結(jié)果45-48
• 3.1 PCR初步篩選結(jié)果45-46
• 3.2 轉(zhuǎn)基因陽性小鼠PCR產(chǎn)物測序結(jié)果正確46
• 3.3 免疫組化結(jié)果46-47
• 3.4 PRP蛋白表達(dá)水平47-48
• 3.5 ELIASA檢測血清睪酮含量48
• 4 討論48-49
• 5 小結(jié)49-50
• 全文總結(jié)50-51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 文獻(xiàn)綜述55-63
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 致謝63

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本文編號：335124