本文關(guān)鍵詞：噬菌體展示技術(shù)體內(nèi)篩選人膀胱癌細(xì)胞特異性結(jié)合肽，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:利用噬菌體展示技術(shù)通過體內(nèi)篩選的方法得到能夠和人膀胱移行細(xì)胞癌BIU87細(xì)胞特定結(jié)合起來的小分子多肽。方法:將人膀胱移行細(xì)胞癌BIU87細(xì)胞接種于裸鼠體內(nèi),制備膀胱癌荷瘤裸鼠模型。經(jīng)荷瘤裸鼠尾靜脈將噬菌體展示環(huán)七肽庫(kù)注入其體內(nèi),篩選可同膀胱移行細(xì)胞癌組織特異性結(jié)合的單克隆噬菌體。經(jīng)過三輪體內(nèi)篩選后,運(yùn)用免疫組織化學(xué)法顯示噬菌體在體內(nèi)腫瘤及各組織的分布情況,同時(shí)隨機(jī)挑取三十個(gè)單克隆噬菌體,運(yùn)用酶聯(lián)免疫法觀察噬菌體對(duì)人膀胱移行細(xì)胞癌BIU87細(xì)胞親和力大小。將陽(yáng)性表達(dá)的噬菌體DNA提取出來,并進(jìn)行序列測(cè)定,推算出插入多肽的氨基酸序列,通過軟件庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)分析。多肽通過固相合成法合成,并標(biāo)記熒光素異硫氰酸成為熒光探針。MTT法檢測(cè)多肽及熒光探針對(duì)BIU87細(xì)胞的毒性。激光掃描共焦顯微鏡術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)鑒定熒光探針對(duì)人膀胱移行細(xì)胞癌BIU87細(xì)胞的親和性。免疫熒光組織化學(xué)法鑒定熒光探針對(duì)膀胱腫瘤患者病理組織的特異性。結(jié)果:1環(huán)七肽庫(kù)經(jīng)尾靜脈注射入荷瘤裸鼠體內(nèi),噬菌體滴度及組化染色結(jié)果顯示:隨著篩選逐輪進(jìn)行,噬菌體在荷瘤裸鼠的膀胱腫瘤組織中出現(xiàn)明顯富集,當(dāng)篩選到第三輪結(jié)束時(shí),回收率是首輪篩選結(jié)束后的4.334×102倍;肝臟與腎臟組織因血管豐富、代謝速度快等特點(diǎn),可以非特異的吸附大量噬菌體肽庫(kù),而膀胱、肺與肌肉組織只有少量噬菌體肽庫(kù)結(jié)合。2體內(nèi)篩選三輪結(jié)束后,隨機(jī)挑取三十個(gè)藍(lán)色單克隆噬菌體,利用酶免法初步檢測(cè)單克隆噬菌體對(duì)BIU87細(xì)胞的親和力,結(jié)果顯示:共有二十四個(gè)單克隆噬菌體親和力≥2,是陽(yáng)性表達(dá)的噬菌體克隆,陽(yáng)性率達(dá)80%,其中有十個(gè)單克隆噬菌體親和力≥5,將其擴(kuò)增并對(duì)DNA進(jìn)行提取、測(cè)序、翻譯,共獲得三條序列:CSSPIGRHC(8/10)、CTMSNLKGC(1/10)及CNNVLSQMC(1/10)。將重復(fù)率最高的多肽序列CSSPIGRHC命名為NYZL1,運(yùn)用Ex PASy/Prot Param、NCBI/BLAST等數(shù)據(jù)庫(kù)分析,上述序列之間沒有同源性,NYZL1與目前所知的基因和蛋白沒有發(fā)現(xiàn)同源性,且國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均沒有相關(guān)報(bào)道。3固相合成NYZL1及FITC-NYZL1,并與BIU87細(xì)胞孵育,PBS作空白對(duì)照,觀察多肽及熒光探針對(duì)BIU87細(xì)胞的毒性,結(jié)果表明多肽及熒光探針在~100μmol/L濃度范圍內(nèi)孵育細(xì)胞24小時(shí),對(duì)BIU87細(xì)胞的增殖及活性無(wú)影響,同時(shí)表明熒光標(biāo)記物FITC不會(huì)破壞多肽NYZL1的分子構(gòu)象。4將FITC-NYZL1及FITC-sv NYZL1與BIU87細(xì)胞孵育,PBS作空白對(duì)照,使用共聚焦顯微鏡鏡下觀察其結(jié)合情況,結(jié)果表明FITC-NYZL1在BIU87細(xì)胞上有高富集熒光亮點(diǎn),且均勻結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中,表明FITC-NYZL1與BIU87細(xì)胞具有親和力和特異性。5將FITC-NYZL1及FITC-sv NYZL1與BIU87細(xì)胞孵育后流式細(xì)胞儀觀察,結(jié)果顯示FITC-NYZL1與BIU87細(xì)胞結(jié)合的熒光強(qiáng)度值為53.1925±1.35,FITC-sv NYZL1與BIU87細(xì)胞結(jié)合的熒光強(qiáng)度值為15.17±1.06,PBS空白對(duì)照熒光強(qiáng)度值為6.67±0.10,P0.01,差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)中有意義,表明FITC-NYZL1與BIU87細(xì)胞具有親和力和特異性。6將FITC-NYZL1、FITC-sv NYZL1分別孵育膀胱腫瘤患者病理組織及癌旁正常膀胱組織石蠟切片,熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示,在膀胱腫瘤組織切片中,FITC-NYZL1組熒光富集度高,平均熒光強(qiáng)度為1974.04±407.57,FITV-sv NYZL1組熒光很弱,平均熒光強(qiáng)度為140.07±178.23,而在癌旁正常膀胱組織切片中,兩組熒光顯示都很弱,平均熒光強(qiáng)度值分別為349.27±46.29、155.79±143.37,表明FITC-NYZL1能特異性的結(jié)合于膀胱腫瘤組織,且親和力高。結(jié)論:本次實(shí)驗(yàn)快速有效的構(gòu)建了BIU87細(xì)胞荷瘤裸鼠模型,通過體內(nèi)篩選獲得了能夠與膀胱腫瘤細(xì)胞特定結(jié)合的多肽NYZL1,并進(jìn)一步證實(shí)FITC-NYZL1對(duì)膀胱尿路癌細(xì)胞及組織的特異性,顯示人膀胱移行細(xì)胞癌BIU87細(xì)胞表面有多肽NYZL1的特異性結(jié)合位點(diǎn)。多肽NYZL1可能成為膀胱癌相關(guān)抗原的新配體,為診斷早期膀胱癌和靶向性治療提供一定的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：膀胱癌 噬菌體展示技術(shù) BIU87細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.14
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 常用縮寫詞中英文對(duì)照表11-12
• 前言12-15
• 1 材料與方法15-26
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器15-18
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法18-26
• 2 結(jié)果26-35
• 2.1 成功建立異體移植BIU87 細(xì)胞荷瘤裸鼠模型26
• 2.2 噬菌體展示環(huán)七肽庫(kù)體內(nèi)篩選膀胱癌細(xì)胞靶向肽26-27
• 2.3 噬菌體肽庫(kù)在腫瘤及其他組織的分布情況27-28
• 2.4 陽(yáng)性噬菌體克隆與膀胱癌細(xì)胞的親和力28-29
• 2.5 膀胱癌細(xì)胞特異結(jié)合的噬菌體DNA的測(cè)序29-31
• 2.6 化學(xué)合成肽31-32
• 2.7 MTT鑒定多肽及熒光探針的細(xì)胞毒性32
• 2.8 共焦顯微鏡術(shù)鑒定熒光探針與BIU87 細(xì)胞的特異性32-33
• 2.9 流式細(xì)胞術(shù)鑒定熒光探針與BIU87 細(xì)胞的特異性33-34
• 2.10 免疫熒光鑒定探針的組織特異性34-35
• 3 討論35-39
• 4 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-43
• 附圖43-44
• 綜述44-50
• 參考文獻(xiàn)48-50
• 致謝50-52
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果52-53
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷53

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 楊國(guó)良;薄雋杰;;尿液中膀胱腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的研究進(jìn)展[J];中國(guó)癌癥雜志;2009年07期

  本文關(guān)鍵詞：噬菌體展示技術(shù)體內(nèi)篩選人膀胱癌細(xì)胞特異性結(jié)合肽，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：332980