目的 :構(gòu)建大鼠生長阻滯及DNA損傷誘導(dǎo)基因45（growth arrest and DNA-damage-inducible gene 45,Gadd45）β/γ啟動子（全長和截短）熒光素酶報告質(zhì)粒,并觀察在大鼠腎小球系膜細胞（glomerular messangial cells,GMCs）中過表達激活轉(zhuǎn)錄因子3（activating transcription factor 3,ATF3）后分別對大鼠Gadd45β/γ基因啟動活性的影響。同時篩選其可能的ATF3結(jié)合位點。方法:采用PCR技術(shù),將擴增出的大鼠Gadd45β基因啟動子全長（-1 105⁺236 nt）和Gadd45γ基因啟動子全長（-913⁺72nt）分別插入到熒光素酶報告基因載體p GL3-basic中,獲得Gadd45β/γ基因啟動子全長熒光素酶報告質(zhì)粒（p GL3-Gadd45β/γ-FL）,再將p GL3-Gadd45β/γ-FL分別與課題組前期構(gòu)建的大鼠野生型ATF3過表達質(zhì)粒（p IRES2/ATF3）共轉(zhuǎn)染GMCs,檢測其熒光素酶活性,以確定ATF3對Gadd... 

【文章來源】：南京醫(yī)科大學學報(自然科學版). 2016,36(01)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

ATF3對大鼠Gadd45β／γ基因啟動子全長活性的影響

所得的測序序列與NCBI上報告序列進行比對后證實，兩者序列及插入方向均正確。表明大鼠Gadd45β／γ基因啟動子全長熒光素酶報告質(zhì)粒（pGL3-Gadd45β／γ-FL）已成功構(gòu)建。2．2ATF3過表達對大鼠Gadd45β／γ基因啟動子全長活性的影響按不同實驗分組轉(zhuǎn)染后48h，裂解細胞行雙熒光素酶報告基因檢測。結(jié)果顯示，pGL3-Gadd45β／γ-FL和pIRES2／ATF3聯(lián)合轉(zhuǎn)染組，其RLU值顯著高于其分各組（圖2）。提示，在GMCs中過表達ATF3能夠啟動Gadd45β／γ基因的轉(zhuǎn)錄。1：pGL3-Gadd45β-FL；2：pGL3-Gadd45γ-FL；M：DL2000Marker。圖1Gadd45β／γ基因啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒的PCR鑒定Figure1IdentificationofGadd45β／γpromoterluciferasereporterplasmidsbyPCR12M2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp周夢雅，何風霞，張婧，等．轉(zhuǎn)錄因子ATF3對大鼠Gadd45β／γ基因啟動活性的影響及其可能的結(jié)合部位［J］．南京醫(yī)科大學學報（自然科學版），2016，36（1）：26－32第36卷第1期2016年1月·29·

南京醫(yī)科大學學報第36卷第1期2016年1月**P＜0．001vs．pGL3-Gadd45β-FL組。圖4ATF3對大鼠Gadd45β基因啟動子各截短片段活性的影響Figure4TheeffectsofATF3ontheactivityofdifferenttruncatedratGadd45βgenepromoters25020015010050403020103210RLU值／MEMgrouppGL3-Gadd45β-FLpGL3-basicpGL3-Gadd45β-1pGL3-Gadd45β-2pGL3-Gadd45β-3pGL3-Gadd45β-4******pRL-40＋pIRES2／ATF3**P＜0．001vs．pGL3-Gadd45γ-FL組。圖5ATF3對大鼠Gadd45γ基因啟動子各截短片段活性的影響Figure5TheeffectsofATF3ontheactivityofdifferenttruncatedratGadd45γgenepromoters2502001501005020151053210RLU值／pGL-3basicpGL3-Gadd45γ-FLpGL3-basicpGL3-Gadd45γ-1pGL3-Gadd45γ-2pGL3-Gadd45γ-3****pRL-40＋pIRES2／ATF32．3大鼠Gadd45β／γ基因啟動子各截短片段熒光素酶報告質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定大鼠Gadd45β／γ基因啟動子各截短片段熒光素酶報告質(zhì)粒的菌液PCR鑒定結(jié)果如圖3所示，目的片段大小均相吻合。DNA測序結(jié)果亦顯示序列及插入方向均正確。表明大鼠Gadd45β／γ基因啟動子截短片段熒光素酶報告質(zhì)粒均已構(gòu)建成功，可用于后續(xù)功能實驗。2．4ATF3過表達對大鼠Gadd45β基因啟動子各截短片段活性的影響將pGL3-basic、Gadd45β基因啟動子全長（pGL3-Gadd45β-FL）和各截短片?


本文編號：3319367