發(fā)布時(shí)間：2021-07-30 14:43

　　目的:研究與探討精子相關(guān)抗原6（SPAG6）在小鼠精子發(fā)生過程中頂體形成階段的表達(dá)及其調(diào)控作用。方法:以小鼠睪丸組織cDNA為模板PCR擴(kuò)增SPAG6和SPINK2蛋白編碼區(qū)域,構(gòu)建pGBKT7/SPAG6、pGADT7/SPINK2、pEGFP-N2/SPAG6和pCS3+FLT/SPINK2表達(dá)質(zhì)粒,并通過酶切鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒是否構(gòu)建成功;分別收集處于第一波精子發(fā)生階段（出生后8、12、16、20、24、28、30和35天）雄性小鼠睪丸組織,Western blot研究第一波精子發(fā)生中SPAG6的表達(dá)情況;分離成年雄性小鼠睪丸組織混合生精細(xì)胞,免疫熒光觀察SPAG6在生精細(xì)胞中的定位;將構(gòu)建的pGBKT7/SPAG6和pGADT7/SPINK2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到AH109感受態(tài)細(xì)胞,直接酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SPAG6與SPINK2蛋白間相互作用;將pTarget/SPAG6和pEGFP-N2/SPINK2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞,免疫熒光染色后觀察SPAG6與SPINK2在細(xì)胞中的定位情況;將pCS3+FLT/SPINK2和pEGFP-N2/SPAG6表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到COS-1細(xì)胞,免疫共... 

【文章來源】：武漢科技大學(xué)湖北省

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮寫對照表
第1章 前言
第2章 材料
    2.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)主要菌株和載體
    2.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器
    2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    2.5 主要實(shí)驗(yàn)試劑的配制
        2.5.1 10%SDS溶液
        2.5.2 5×TBE電泳緩沖液溶液
        2.5.3 1%電泳凝膠
        2.5.4 LB液體培養(yǎng)基
        2.5.5 LB固體培養(yǎng)基
        2.5.6 RIPA Buffer緩沖液
        2.5.7 10×TBST溶液
第3章 方法
    3.1 小鼠睪丸組織總RNA提取及CDNA合成
        3.1.1 小鼠睪丸組織總RNA提取
        3.1.2 小鼠睪丸組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
    3.2 質(zhì)粒構(gòu)建
        3.2.1 Spag6和Spink2引物設(shè)計(jì)
        3.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)
        3.2.3 PCR產(chǎn)物的凝膠電泳鑒定
        3.2.4 PCR產(chǎn)物的回收純化
        3.2.5 TA克隆及其連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.2.6 陽性菌落的質(zhì)粒提取
        3.2.7 pClone007/SPAG6和pClone007/SPINK2 重組質(zhì)粒酶切及基因測序驗(yàn)證
        3.2.8 目的片段SPAG6、SPINK2及目標(biāo)載體的回收純化
        3.2.9 目的片段SPAG6、SPINK2與目標(biāo)載體的連接轉(zhuǎn)化
        3.2.10 SPAG6和SPINK2 重組質(zhì)粒酶切鑒定
    3.3 小鼠睪丸組織總蛋白提取與測定
        3.3.1 小鼠睪丸組織總蛋白提取
        3.3.2 小鼠睪丸組織總蛋白測定
    3.4 Western blot檢測小鼠睪丸組織蛋白表達(dá)
        3.4.1 小鼠睪丸組織中SPAG6蛋白的表達(dá)
        3.4.2 Spag6基因敲除小鼠睪丸組織中SPINK2表達(dá)
    3.5 免疫熒光觀察SPAG6在生精細(xì)胞中的定位
        3.5.1 小鼠混合生精細(xì)胞的分離
        3.5.2 生精細(xì)胞免疫熒光染色
    3.6 直接酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SPAG6和SPINK2 蛋白間相互作用
        3.6.1 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.6.2 pGBKT7/SPAG6+ pGADT7/SPINK2 混合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母感受態(tài)細(xì)胞
    3.7 細(xì)胞內(nèi)共定位實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SPAG6與SPINK2 蛋白間的相互作用
        3.7.1 重組質(zhì)粒pTarget/SPAG6和pEGFP-N2/SPINK2 轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞
        3.7.2 CHO細(xì)胞的免疫熒光染色
    3.8 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SPAG6與SPINK2 蛋白間的相互作用
    3.9 SPINK2在Spag6基因敲除小鼠睪丸生精細(xì)胞中的表達(dá)與定位
第4章 結(jié)果
    4.1 SPAG6和SPINK2重組質(zhì)粒的鑒定
    4.2 第一波精子發(fā)生中SPAG6蛋白表達(dá)水平
    4.3 SPAG6 定位于圓形精子的頂體
    4.4 直接酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SPAG6和SPINK2 蛋白間相互作用
    4.5 細(xì)胞內(nèi)共定位實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SPAG6與SPINK2 蛋白間的相互作用
    4.6 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SPAG6與SPINK2蛋白間的相互作用
    4.7 SPAG6蛋白缺失可能導(dǎo)致小鼠精子頂體形成受阻
第5章 討論
第6章 結(jié)論與展望
致謝
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
附錄1 質(zhì)粒載體圖譜
附錄2 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文
附錄3 攻讀碩士學(xué)位期間參加的科研項(xiàng)目


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3311597