發(fā)布時(shí)間：2017-04-26 20:10

  本文關(guān)鍵詞：自噬在衰老自發(fā)性高血壓大鼠足細(xì)胞損傷中的作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景原發(fā)性高血壓是最常見的慢性非傳染性疾病,其患病率、發(fā)病率及血壓水平隨年齡增加而升高。隨著降壓藥的普遍應(yīng)用,高血壓引起的心腦血管并發(fā)癥已明顯下降,但由于高血壓腎損傷引起的終末期腎臟疾病(end-stage renal disease, ESRD)比例卻明顯的增加。有臨床橫斷面研究提示,至2012年,中國18歲以上人群中有1.2億慢性腎臟病患者,高血壓和糖尿病患病率的攀升將會(huì)導(dǎo)致慢性腎臟病的激增。據(jù)美國腎臟數(shù)據(jù)登記系統(tǒng)2013年的年度報(bào)告顯示,2011年美國ESRD患者中約24.8%的原發(fā)病是高血壓腎損傷,僅次于糖尿病腎病,自2000年以來比例增長了8.7%,這提示目前臨床應(yīng)用的降壓藥對(duì)于保護(hù)腎功來說還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的,因此進(jìn)一步研究高血壓腎損傷的發(fā)病機(jī)制,并針對(duì)性應(yīng)用相關(guān)藥物防治高血壓腎損傷十分必要。“自噬”一詞于1963年首次由諾貝爾獎(jiǎng)獲得者,de Duve用于描述胞內(nèi)廢棄細(xì)胞器被包裹于單層或雙層膜結(jié)構(gòu)中,進(jìn)而被消化降解的這一現(xiàn)象。自噬通過降解細(xì)胞內(nèi)多余的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、廢棄細(xì)胞器達(dá)到清除廢物、更新胞內(nèi)物質(zhì)、回收能源、營養(yǎng),維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的目的,是真核細(xì)胞高度保守的細(xì)胞適應(yīng)機(jī)制,實(shí)驗(yàn)證明,抑制自噬可加速衰老,促進(jìn)自噬可延長壽命,在自然衰老過程中,自噬活性逐漸降低。終末分化細(xì)胞如神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腎小球足細(xì)胞等如果出現(xiàn)自噬缺陷可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量廢棄蛋白、細(xì)胞器堆積,使得此類細(xì)胞無法有效地應(yīng)對(duì)外界有害刺激。自噬的有利一面是得到充分驗(yàn)證的,但是自噬有其不利一面,某些疾病的死亡細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大量的自噬體,有學(xué)者認(rèn)為是自噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡,即通常所說的Ⅱ型程序性死亡,可能是由于過度降解細(xì)胞內(nèi)組成物質(zhì)而造成。腎小球足細(xì)胞參與腎小球?yàn)V過屏障的組成,無時(shí)無刻不與細(xì)胞毒性物質(zhì)及炎癥大分子接觸,易發(fā)生氧化應(yīng)激及脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)損傷,而腎小球足細(xì)胞損傷是包括高血壓腎損傷在內(nèi)多種腎臟疾病難以治愈的關(guān)鍵所在,嚴(yán)重的、進(jìn)行性的足細(xì)胞損傷可導(dǎo)致腎小球硬化等多種腎臟病變,最終進(jìn)入ESRD。作為終末分化細(xì)胞,足細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞相似,主要是通過自噬而不是細(xì)胞分裂來減少胞內(nèi)積累的損傷DNA和大分子物質(zhì),體外實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、人腎活檢均提示足細(xì)胞存在較高水平的基礎(chǔ)自噬,且在維持足細(xì)胞的穩(wěn)定中起到重要的作用。目前認(rèn)為局部和/或循環(huán)系統(tǒng)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin-system, RAS)的異常激活參于原發(fā)性高血壓的發(fā)病及維持,而腎臟表達(dá)RAS所有成員,腎臟RAS對(duì)原發(fā)性高血壓的發(fā)生發(fā)展起到重要作用,同時(shí)RAS中致血壓升高的主要活性物質(zhì)血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)可通過抑制足細(xì)胞足突重要組成蛋白nephrin的表達(dá)或促進(jìn)氧化應(yīng)激作用導(dǎo)致腎小球足細(xì)胞損傷,近年發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ可誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬,尚不清楚Ang Ⅱ誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬與Ang Ⅱ誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷有何關(guān)聯(lián)。目的觀察正常血壓衰老及高血壓衰老時(shí)大鼠腎皮質(zhì)RAS及腎小球足細(xì)胞自噬的變化,進(jìn)一步探討高血壓衰老時(shí)腎損傷的可能機(jī)制,然后用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(Angiotensin converting enzyme inhibitors, ACEI)貝那普利和Ang Ⅱ受體拮抗劑(Ang Ⅱ receptor blockers, ARB)氯沙坦分別干預(yù)老年自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR),觀察貝那普利和氯沙坦對(duì)老年SHR腎小球足細(xì)胞自噬的影響,進(jìn)一步探討ACEI/ARB腎臟保護(hù)作用的新機(jī)制。方法(1)正常血壓大鼠Wistar-Kyoto-rat (WKY)分為3、13、22月齡組,均有性別、月齡、數(shù)量相匹配的SHR作為對(duì)照。監(jiān)測大鼠血壓；檢測尿蛋白、尿肌酐、血肌酐(serum creatinine,SCR)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血清和腎皮質(zhì)腎素活性、Ang Ⅱ水平；觀察腎組織光鏡、透射電鏡下形態(tài)學(xué)改變,計(jì)數(shù)足細(xì)胞內(nèi)自噬體；western blot法檢測腎小球Ang Ⅲ型受體(Ang Ⅱ type 1 receptor,AT1R)、AngⅡ2型受體(Ang Ⅱ type 2 receptor, AT2R)、 nephrin、Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5、p62表達(dá)情況。(2)18月齡雄性WKY為NORM組[生理鹽水2ml/d],18月齡雄性SHR隨機(jī)分為4組：CTRL組[生理鹽水2mVd]、ACEI組[貝那普利10mg/(kg.d)]、ARB組[氯沙坦30mg/(kg.d)]、Combined組[貝那普利10mg/(kg.d)+氯沙坦30mg/(kg.d)],每組均為6只,實(shí)驗(yàn)干預(yù)4個(gè)月。定期監(jiān)測大鼠血壓；實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)檢測尿蛋白、尿肌酐、SCR、BUN.血清及腎皮質(zhì)腎素活性、Ang Ⅱ水平；觀察腎組織光鏡和電鏡下形態(tài)學(xué)改變,計(jì)數(shù)足細(xì)胞內(nèi)自噬體；western blot法檢測腎小球nephrin、 Beclin1、LC3B-Ⅱ、Atg5和p62蛋白表達(dá)情況。結(jié)果(1)WKY及SHR血壓隨著月齡增加均無明顯變化(P0.05),但SHR血壓均明顯高于同月齡WKY(P0.05)。(2)正常血壓衰老及高血壓衰老時(shí),尿蛋白/尿肌酐比值均明顯升高(均P0.05)SHR尿蛋白/尿肌酐比值均明顯高于同月齡WKY(P0.05)。(3)正常血壓衰老及高血壓衰老時(shí),SCR、BUN水平均無明顯變化(均P0.05)；兩組比較,僅3月齡、13月齡SHR的BUN水平分別明顯高于同月齡WKY(均P0.05)。(4)正常血壓衰老時(shí),血清及腎皮質(zhì)腎素活性、Ang Ⅱ水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)；高血壓衰老時(shí),血清及腎皮質(zhì)腎素活性、血清Ang Ⅱ水平隨增齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05),但腎皮質(zhì)Ang Ⅱ水平隨增齡明顯降低(P0.05)。(5)正常血壓衰老及高血壓衰老時(shí)腎臟均出現(xiàn)腎小球硬化、腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化等衰老病變,但以高血壓衰老時(shí)病變更為嚴(yán)重；正常血壓衰老時(shí)腎小球足細(xì)胞自噬體相對(duì)堆積。(6)正常血壓衰老時(shí)腎小球AT1R、AT2R、Beclin 1蛋白表達(dá)無明顯變化(P0.05), LC3B-Ⅱ、Atg5、p62蛋白表達(dá)明顯增多(均P0.05)；高血壓衰老時(shí)腎小球AT1R蛋白表達(dá)明顯增多,AT2R、nephrin、Beclin 1、 LC3B-Ⅱ、Atg5、p62蛋白表達(dá)明顯減少(均P0.05)。(7)藥物干預(yù)后,4組SHR血壓、尿蛋白/尿肌酐比值仍明顯高于NORM組,但ARB組、Combined組血壓、尿蛋白/尿肌酐比值明顯低于CTRL組(均P0.05)。(8)藥物干預(yù)后,各組SCR、BUN差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。(9)藥物干預(yù)后,CTRL組、Combined組腎皮質(zhì)腎素活性明顯低于NORM組(均P0.05)；Combined組血清Ang Ⅱ水平明顯高于CTRL組(均P0.05)；4組SHR腎皮質(zhì)Ang Ⅱ水平明顯低于NORM組,ARB組腎皮質(zhì)Ang Ⅱ水平明顯高于CTRL組(均P0.05)。(10)藥物干預(yù)后,4組SHR均可見腎小球缺血皺縮,足突融合、消失,灶性小管萎縮及間質(zhì)纖維化,但以CTRL組病變較重,Combined組病變較輕,NORM組、Combined組足細(xì)胞內(nèi)自噬體明顯多于CTRL組(均P0.05)。(11)藥物干預(yù)后,CTRL組nephrin、Beclin 1、LC3B-Ⅱ、Atg5、p62水平明顯低于NORM組；ACEI組nephrin、Beclin 1、LC3B-Ⅱ、Atg5水平、ARB組和Combined組nephrin、Beclin 1、LC3B-Ⅱ、Atg5、p62水平均明顯高于CTRL組(均P0.05)。討論(1)本實(shí)驗(yàn)無論是正常血壓衰老的WKY還是高血壓衰老的SHR在結(jié)構(gòu)上均出現(xiàn)腎小球硬化、腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化等衰老病理變化,但明顯的SHR病變更加嚴(yán)重；功能上,WKY和SHR隨著月齡的增加尿蛋白／尿肌酐比值明顯上升,且SHR尿蛋白／尿肌酐比值明顯高于同月齡WKY,說明衰老是腎臟結(jié)構(gòu)變化、功能衰退的因素之一,而高血壓則加重了這些衰變。(2)正常血壓衰老時(shí)腎小球LC3B-Ⅱ、Atg5、p62表達(dá)明顯上升,高血壓衰老時(shí)腎小球Beclin 1、LC3B-Ⅱ、Atg5、p62表達(dá)明顯下降,電鏡所見正常血壓衰老時(shí)腎小球足細(xì)胞自噬體堆積,說明WKY腎小球足細(xì)胞隨增齡細(xì)胞內(nèi)自噬體有所堆積,自噬活性是下降的,SHR腎小球足細(xì)胞自噬活性相對(duì)升高。(3)高血壓衰老時(shí)腎小球nephrin表達(dá)明顯少于同月齡WKY,電鏡可見老年SHR足細(xì)胞足突明顯融合脫失,可知高血壓衰老時(shí)腎小球足細(xì)胞發(fā)生損傷。高血壓衰老時(shí)腎皮質(zhì)AngⅡ水平明顯降低,腎小球AT1R蛋白表達(dá)明顯增多,AT2R蛋白表達(dá)明顯下降,足細(xì)胞自噬活性增高,推測高血壓衰老時(shí),Ang Ⅱ通過表達(dá)增多的AT1R持續(xù)刺激足細(xì)胞,誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬活性保持在高水平或是過度增強(qiáng),自噬降解包括nephrin在內(nèi)的足細(xì)胞大分子結(jié)構(gòu)蛋白過多,此類蛋白清除多于合成,足細(xì)胞就會(huì)發(fā)生損傷,這可能是高血壓衰老時(shí)腎損傷的機(jī)制之一。(4) ACEI/ARB干預(yù)后,與CTEL組相比,ARB組、Combined組尿蛋白/尿肌酐比值明顯降低,且ACEI組、ARB組、Combined組腎小球nephrin蛋白表達(dá)水平明顯升高,光鏡和電鏡觀察4組SHR中以Combined組腎臟病變較輕,提示ACEI/ARB對(duì)腎臟具有保護(hù)作用。(5) ACEI/ARB干預(yù)后,電鏡所見ACEI組、ARB組、Combined組腎小球足細(xì)胞自噬體均增多,其中Combined組的明顯多于CTRL組,結(jié)合western blot結(jié)果,提示ACEI/ARB干預(yù)后老年SHR腎小球足細(xì)胞自噬體有所堆積,自噬活性減弱。(6)結(jié)合本實(shí)驗(yàn)所見,得出以下推測：老年SHR腎小球足細(xì)胞自噬活性過度增強(qiáng),包括nephrin在內(nèi)的足細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白被過度降解而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷,甚至是足細(xì)胞死亡,促進(jìn)了高血壓腎損傷的發(fā)生及發(fā)展；ACEI/ARB干預(yù)后,老年SHR足細(xì)胞自噬活性下調(diào),nephrin等結(jié)構(gòu)蛋白合成速度大于降解速度,大鼠腎臟顯微結(jié)構(gòu)病變緩解,腎功能有所改善。ACEI/ARB可能通過調(diào)控腎小球足細(xì)胞自噬途徑起到了保護(hù)腎臟的作用,這一推測有待具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。
【關(guān)鍵詞】：高血壓腎損傷 腎素-血管緊張素系統(tǒng) 足細(xì)胞 自噬 ACEI ARB
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R544.1;R692
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-20
• 材料和方法20-29
• 1. 材料和試劑20-22
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法22-29
• 結(jié)果29-37
• 1. 大鼠血壓情況29-30
• 2. 大鼠腎功能比較30-31
• 3. 大鼠血清及腎皮質(zhì)腎素活性、AngⅡ水平比較31-32
• 4. 大鼠腎皮質(zhì)PAS觀察32-34
• 5. 大鼠腎皮質(zhì)電鏡觀察34-35
• 6. 各組大鼠腎小球各指標(biāo)蛋白表達(dá)的變化35-37
• 討論37-43
• 小結(jié)43-44
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 綜述49-58
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 中英文對(duì)照縮略詞表58-59
• 攻讀學(xué)位期間成果59-60
• 致謝60-61

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：329139