研究背景:我國慢性腎臟�。╟hronic kidney disease,CKD）的患病率高達(dá)10.8%,但知曉率僅為12.5%,且發(fā)病率和死亡率居高不下。CKD主要臨床表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過率（estimated glomerular filtration rate,eGFR）顯著下降、尿蛋白逐漸增加,而且經(jīng)常伴隨有腸道、心血管、內(nèi)分泌等多系統(tǒng)的并發(fā)癥。其中,心血管疾�。╟ardiovascular disease,CVD）是CKD最常見的并發(fā)癥和首位（超過50%）死亡原因,而腸道功能紊亂也是CKD的常見并發(fā)癥,臨床表現(xiàn)為食欲減退、惡心、嘔吐、腹瀉、便秘,晚期患者腸黏膜糜爛、潰瘍、出血,患者常常以腸道功能紊亂為首發(fā)癥狀。反過來,腸道功能紊亂又會促進(jìn)尿毒癥毒素的生成,進(jìn)一步加重腎損傷及其并發(fā)癥,尤其是CVD。高達(dá)30%的CKD患者并發(fā)心衰,而40-50%的心衰病人合并有慢性腎功能不全。所以腎臟、腸道、心臟作為一個整體而相互影響,鑒于三者之間存在如此密切的聯(lián)系,近期有研究人員將三者合稱為“腎-腸-心”軸,其功能紊亂將形成惡性循環(huán),最終導(dǎo)致CKD及其并發(fā)癥的進(jìn)展。因此探索CKD合并腸、心功能紊亂的... 

【文章來源】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：167 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

CKD小鼠的腸黏膜屏障被破壞：對照組和小鼠腸上皮組織染色（標(biāo)尺μm，下同），每組只小鼠

陸軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文—41—鑒于腸道菌群失調(diào)可能參與腸黏膜屏障損傷[8,10]，我們收集了對照組和CKD組小鼠的新鮮糞便，進(jìn)行16s核糖體RNA（16sribosomalRNA，16srRNA）測序。韋恩圖和主成分分析發(fā)現(xiàn)，CKD小鼠的菌群操作分類單元發(fā)生顯著改變（圖2A、2B）；而且α多樣性對比提示，CKD小鼠的菌群多樣性降低（圖2C），提示腸道菌群紊亂。熱圖分析在種屬水平進(jìn)一步證實(shí)：CKD小鼠腸道大腸桿菌顯著升高，而乳酸桿菌顯著降低（圖2D）。圖2CKD小鼠腸道菌群紊亂收集對照組和CKD組小鼠的新鮮糞便，每組各取6例，送16srRNA測序。A：韋恩圖分析。B：主成分分析。C：α多樣性對比。D：熱圖分析。2.3.2硫酸吲哚酚誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞黏膜屏障損傷既往文獻(xiàn)報道：大腸桿菌通過色氨酸酶將腸道中的色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚，而乳酸桿菌能將色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚-3-醛基，進(jìn)而競爭性地抑制吲哚的產(chǎn)生[59,60]。再結(jié)合16sRNA測序結(jié)果，我們提出假設(shè)：吲哚可能直接誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞損傷？但是，我們用吲哚處理結(jié)腸上皮細(xì)胞系Caco2后卻發(fā)現(xiàn)：跨上皮電阻（transepithelialelectricalresistance，TER）和緊密連接相關(guān)基因（ZO1、Occludin、Claudin-1和Claudin-2）的表達(dá)均未見明顯降低（圖3A、3B）。相反，高濃度的吲哚（1mM）甚至能在一定程

陸軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文—42—度上促進(jìn)TER，以及Claudin-1、Claudin-2基因的表達(dá)。這些結(jié)果提示，吲哚并不能損傷腸上皮細(xì)胞的緊密連接。圖3吲哚未損傷腸上皮細(xì)胞的緊密連接A：Caco2細(xì)胞接種于Millicell細(xì)胞培養(yǎng)孔培養(yǎng)14天，用不同劑量的吲哚處理Caco2細(xì)胞24h或用1mM吲哚處理不同的時間，測定TER的變化。B：用試劑對照或1mM吲哚處理Caco2細(xì)胞24h后，qPCR檢測緊密連接相關(guān)基因的表達(dá)。ns：無顯著差異，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。因此，我們進(jìn)一步分析了吲哚衍生物：蛋白結(jié)合毒素IS，IS常蓄積于CKD患者體內(nèi)，損傷腎小球、腎小管，誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化，進(jìn)而促進(jìn)CKD進(jìn)展[19]。我們用IS處理Caco2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TER值和緊密連接相關(guān)基因（ZO1、Occludin、Claudin-1和Claudin-2）表達(dá)均顯著降低（圖4A、4B）。進(jìn)一步地，我們往小鼠腹腔注射100mg/kgIS，取腸組織進(jìn)行HE染色，發(fā)現(xiàn)杯狀細(xì)胞缺失、腸黏膜水腫、壞死、潰瘍，腸組織損傷評分和通透性均顯著升高，同時伴隨著血清IS水平的上升（圖4C-F）。相應(yīng)地，透射電鏡觀察到IS處理組的小鼠腸道組織中緊密連接的密度明顯降低、空隙增大；qPCR實(shí)驗(yàn)提示緊密連接相關(guān)基因表達(dá)顯著下降；ELISA檢測發(fā)現(xiàn)炎癥因子（TNFα、IL-1β和IL-6）顯著升高（圖4G-I）。上述結(jié)果共同提示：IS能促進(jìn)腸上皮細(xì)胞屏障損傷。


本文編號：3271907