發(fā)布時(shí)間：2021-06-23 18:03

　　目的:目前世界范圍內(nèi),糖尿病腎病（diabetic nephropathy,DN）)是導(dǎo)致終末期腎臟疾病的首要原因。盡管嚴(yán)格的血壓和血糖控制能夠有效減緩1型或2型糖尿病所致糖尿病腎病的疾病進(jìn)程,但仍不能完全阻止糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展,因此迫切需要針對(duì)糖尿病腎病的新的治療策略和方法。腎臟的微炎癥狀態(tài)目前已成為糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的重要基礎(chǔ)。炎性小體的活化已在多種腎臟固有細(xì)胞中被報(bào)道,并在糖尿病腎病中得到證實(shí)。細(xì)胞焦亡是一種由炎性caspase-1、caspase-4、caspase-5（鼠caspase-1、caspase-11）所介導(dǎo)的炎癥性程序性細(xì)胞死亡,是機(jī)體對(duì)感染和細(xì)胞損傷的免疫應(yīng)答。這種溶解性的細(xì)胞死亡因具有細(xì)胞溶解和胞質(zhì)內(nèi)容物釋放的特征而與細(xì)胞凋亡不同。這是一種由gasdermin D（GSDMD）介導(dǎo)的細(xì)胞膜裂孔形成并導(dǎo)致細(xì)胞腫脹和破裂的細(xì)胞死亡過(guò)程。作為一種先天免疫反應(yīng),細(xì)胞焦亡曾被認(rèn)為是免疫細(xì)胞所特有的病理生理過(guò)程。然而,腎臟固有細(xì)胞是否通過(guò)細(xì)胞焦亡促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生,又是否可以通過(guò)細(xì)胞焦亡調(diào)控DN的進(jìn)展目前尚不清楚。VX-765是一種有效的生物可利用的無(wú)毒小分子抑制劑... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)遼寧省

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

高糖刺激活化HK-2細(xì)胞NLRC4/caspase-1/GSDMD炎癥信號(hào)通路

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文17干預(yù)后的細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀分析。細(xì)胞裂解液經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，使用抗NLRC4抗體來(lái)共沉淀NLRC4（誘餌蛋白，baitprotein），然后通過(guò)瓊脂糖珠沉淀與NLRC4結(jié)合的caspase-1（靶蛋白，preyprotein），最后通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法應(yīng)用抗caspase-1抗體檢測(cè)蛋白表達(dá)。如圖1-2A所示，對(duì)比IgG對(duì)照組，在IgG重鏈55kDa以下45kDa位置檢測(cè)到caspase-1表達(dá)，提示細(xì)胞裂解液中NLRC4與caspase-1結(jié)合，表明高糖刺激下HK-2細(xì)胞NLRC4/caspase-1炎性小體組裝。為了進(jìn)一步證實(shí)NLRC4是否能活化caspase-1，我們使用小干擾RNA（siRNA）敲減NLRC4的表達(dá)，并觀察活性caspase-1p20片段表達(dá)變化。結(jié)果表明NLRC4敲減可顯著抑制caspase-1活化（如圖1-2B,C）�？梢�(jiàn)，糖尿病狀態(tài)下HK-2細(xì)胞中NLRC4能夠結(jié)合并活化caspase-1。圖1-2.高糖刺激活化HK-2細(xì)胞NLRC4/caspase-1炎性小體A.免疫共沉淀分析表明高糖干預(yù)的HK-2細(xì)胞中NLRC4能夠與caspase-1結(jié)合。B.蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果表明在高糖環(huán)境下敲減HK-2細(xì)胞NLRC4表達(dá)，可顯著抑制caspase-1p20活性片段生成。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果的定量灰度分析見(jiàn)C。結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。CL,cleaved;NTsiRNA,non-targetsiRNA;Veh,vehicle;Gluc,glucose。3.1.3光學(xué)顯微鏡觀察高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變?yōu)榱顺醪皆u(píng)估高糖處理后腎小管上皮細(xì)胞是否發(fā)生細(xì)胞焦亡，于顯微鏡下觀察

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文1825mMD-葡萄糖干預(yù)48小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)改變。同時(shí)以甲磺酸鹽（Val-boroPro）為誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的陽(yáng)性對(duì)照。已有研究表明Val-boroPro可激動(dòng)caspase-1從而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[27]；以依托泊苷（etoposide）為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的陽(yáng)性對(duì)照，已知依托泊苷可通過(guò)抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26]。蛋白質(zhì)免疫印跡法分析Val-boroPro或依托泊苷處理細(xì)胞24小時(shí)后的炎性caspase-1和凋亡caspase-3蛋白表達(dá)情況，結(jié)果證實(shí)Val-boroPro可剪切活化caspase-1，而依托泊苷活化caspase-3（如圖1-3A,B）。顯微鏡下觀察高糖、Val-boroPro和依托泊苷處理后的HK-2細(xì)胞形態(tài)改變，可見(jiàn)高糖處理的細(xì)胞表現(xiàn)出與Val-boroPro組相似的焦亡樣形態(tài)改變（細(xì)胞膜膨脹）（如圖1-3C），提示高糖處理腎小管上皮細(xì)胞可能發(fā)生細(xì)胞焦亡。圖1-3.光鏡下高糖環(huán)境中HK-2細(xì)胞形態(tài)改變A.蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)Val-boroPro（5μM）和依托泊苷（25μM）干預(yù)24小時(shí)后炎性caspase-1和凋亡caspase-3表達(dá)情況，并以DMSO處理為對(duì)照組。B.蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果的定量灰度分析。C.光鏡下觀察到高糖處理后HK-2細(xì)胞表現(xiàn)出與Val-boroPro處理后相似的細(xì)胞膜膨脹的細(xì)胞焦亡樣形態(tài)改變。星號(hào)表示焦亡細(xì)胞的氣球樣改變細(xì)胞膜特征。箭頭表示凋亡細(xì)胞的葡萄串樣細(xì)胞膜出泡。結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。*p<0.05,***p<0.001。VbP,Val-boroPro;Etop.,etoposide;FL,fulllength;CL,cleaved。3.1.4共聚焦顯微鏡分析發(fā)生焦亡的腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變


本文編號(hào)：3245408