目的:目前世界范圍內(nèi),糖尿病腎�。╠iabetic nephropathy,DN）)是導致終末期腎臟疾病的首要原因。盡管嚴格的血壓和血糖控制能夠有效減緩1型或2型糖尿病所致糖尿病腎病的疾病進程,但仍不能完全阻止糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展,因此迫切需要針對糖尿病腎病的新的治療策略和方法。腎臟的微炎癥狀態(tài)目前已成為糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的重要基礎。炎性小體的活化已在多種腎臟固有細胞中被報道,并在糖尿病腎病中得到證實。細胞焦亡是一種由炎性caspase-1、caspase-4、caspase-5（鼠caspase-1、caspase-11）所介導的炎癥性程序性細胞死亡,是機體對感染和細胞損傷的免疫應答。這種溶解性的細胞死亡因具有細胞溶解和胞質(zhì)內(nèi)容物釋放的特征而與細胞凋亡不同。這是一種由gasdermin D（GSDMD）介導的細胞膜裂孔形成并導致細胞腫脹和破裂的細胞死亡過程。作為一種先天免疫反應,細胞焦亡曾被認為是免疫細胞所特有的病理生理過程。然而,腎臟固有細胞是否通過細胞焦亡促進糖尿病腎病的發(fā)生,又是否可以通過細胞焦亡調(diào)控DN的進展目前尚不清楚。VX-765是一種有效的生物可利用的無毒小分子抑制劑... 

【文章來源】：中國醫(yī)科大學遼寧省

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【學位級別】：博士

【部分圖文】：

高糖刺激活化HK-2細胞NLRC4/caspase-1/GSDMD炎癥信號通路

中國醫(yī)科大學博士學位論文17干預后的細胞進行免疫共沉淀分析。細胞裂解液經(jīng)過預處理后，使用抗NLRC4抗體來共沉淀NLRC4（誘餌蛋白，baitprotein），然后通過瓊脂糖珠沉淀與NLRC4結(jié)合的caspase-1（靶蛋白，preyprotein），最后通過蛋白質(zhì)免疫印跡法應用抗caspase-1抗體檢測蛋白表達。如圖1-2A所示，對比IgG對照組，在IgG重鏈55kDa以下45kDa位置檢測到caspase-1表達，提示細胞裂解液中NLRC4與caspase-1結(jié)合，表明高糖刺激下HK-2細胞NLRC4/caspase-1炎性小體組裝。為了進一步證實NLRC4是否能活化caspase-1，我們使用小干擾RNA（siRNA）敲減NLRC4的表達，并觀察活性caspase-1p20片段表達變化。結(jié)果表明NLRC4敲減可顯著抑制caspase-1活化（如圖1-2B,C）�？梢姡悄虿顟B(tài)下HK-2細胞中NLRC4能夠結(jié)合并活化caspase-1。圖1-2.高糖刺激活化HK-2細胞NLRC4/caspase-1炎性小體A.免疫共沉淀分析表明高糖干預的HK-2細胞中NLRC4能夠與caspase-1結(jié)合。B.蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測結(jié)果表明在高糖環(huán)境下敲減HK-2細胞NLRC4表達，可顯著抑制caspase-1p20活性片段生成。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果的定量灰度分析見C。結(jié)果表示為均數(shù)±標準誤。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。CL,cleaved;NTsiRNA,non-targetsiRNA;Veh,vehicle;Gluc,glucose。3.1.3光學顯微鏡觀察高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞形態(tài)學改變?yōu)榱顺醪皆u估高糖處理后腎小管上皮細胞是否發(fā)生細胞焦亡，于顯微鏡下觀察

中國醫(yī)科大學博士學位論文1825mMD-葡萄糖干預48小時后細胞形態(tài)改變。同時以甲磺酸鹽（Val-boroPro）為誘導細胞焦亡的陽性對照。已有研究表明Val-boroPro可激動caspase-1從而誘導細胞焦亡[27]；以依托泊苷（etoposide）為誘導細胞凋亡的陽性對照，已知依托泊苷可通過抑制DNA拓撲異構(gòu)酶II誘導細胞凋亡[26]。蛋白質(zhì)免疫印跡法分析Val-boroPro或依托泊苷處理細胞24小時后的炎性caspase-1和凋亡caspase-3蛋白表達情況，結(jié)果證實Val-boroPro可剪切活化caspase-1，而依托泊苷活化caspase-3（如圖1-3A,B）。顯微鏡下觀察高糖、Val-boroPro和依托泊苷處理后的HK-2細胞形態(tài)改變，可見高糖處理的細胞表現(xiàn)出與Val-boroPro組相似的焦亡樣形態(tài)改變（細胞膜膨脹）（如圖1-3C），提示高糖處理腎小管上皮細胞可能發(fā)生細胞焦亡。圖1-3.光鏡下高糖環(huán)境中HK-2細胞形態(tài)改變A.蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測Val-boroPro（5μM）和依托泊苷（25μM）干預24小時后炎性caspase-1和凋亡caspase-3表達情況，并以DMSO處理為對照組。B.蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果的定量灰度分析。C.光鏡下觀察到高糖處理后HK-2細胞表現(xiàn)出與Val-boroPro處理后相似的細胞膜膨脹的細胞焦亡樣形態(tài)改變。星號表示焦亡細胞的氣球樣改變細胞膜特征。箭頭表示凋亡細胞的葡萄串樣細胞膜出泡。結(jié)果表示為均數(shù)±標準誤。*p<0.05,***p<0.001。VbP,Val-boroPro;Etop.,etoposide;FL,fulllength;CL,cleaved。3.1.4共聚焦顯微鏡分析發(fā)生焦亡的腎小管上皮細胞形態(tài)學改變


本文編號：3245408