第一部分沉默p300、C/EBPp基因?qū)hy-1腎炎大鼠腎組織產(chǎn)生促Th17分化因子和增生病變的影響目的:研究沉默大鼠腎內(nèi)p300、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β（CCAAT enhancer bindingproteinβ,C/EBPβ）基因表達(dá)對Thy-1腎炎大鼠腎組織產(chǎn)生IL-6、TGF-β1（促Th17分化因子）和增生病變的影響。方法:利用三質(zhì)粒系統(tǒng)包裝能表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescence protein,EGFP）的 p300、C/EBPβ基因和亂序陰性對照小發(fā)夾RNA干擾慢病毒表達(dá)載體,經(jīng)腎動脈灌注導(dǎo)入大鼠腎組織。在確定能抑制腎組織中p300、C/EBPβ的表達(dá)后再用兔抗Thy-1抗原的抗體復(fù)制Thy-1腎炎模型,并在腎炎發(fā)病后6h和3d收取標(biāo)本,通過Real-time PCR和蛋白印跡（Westernblot）檢查Thy-1腎炎大鼠腎組織中IL-6,TGF-β1和IL-17的表達(dá)情況。此外,在腎炎發(fā)病后第7d檢查腎炎大鼠腎組織的病理學(xué)改變。結(jié)果:成功包裝出能夠表達(dá)EGFP的p300和C/EBPβ小發(fā)夾RNA干擾慢病毒表達(dá)載體,并建... 

【文章來源】：南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：86 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１?慢病毒載體構(gòu)建所需質(zhì)粒圖譜

腹主動脈的腎動脈開口上下兩端后逆行灌注，可以將慢病毒懸液注入大??鼠雙腎，成功夾閉腹主動脈的腎動脈開口上下兩端后，可以看到腎臟由??于缺血開始發(fā)白（圖２Ｂ、Ｃ）。灌注完畢后，為了使慢病毒能有足夠時??間侵染腎組織細(xì)胞，需夾閉腎門ｌＯｍｉｎ，同時松開腹主動脈上的血管夾??并壓迫止血。盡快開放腹主動脈，使其能最大程度減少大鼠下肢缺血及??腹主動脈血流不暢所導(dǎo)致的下肢器官及心臟的損傷。由于而腎門夾閉時??間過短會影響慢病毒侵染效率，過長（超過１５ｍｉｎ）則可能導(dǎo)致腎臟的??缺血再灌注損傷

南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論３將慢病毒三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染２９３Ｔ細(xì)胞后４８ｈ，熒光顯微鏡檢查轉(zhuǎn)染效率（性對照慢病毒為例）。Ａ．白光視野；Ｂ．熒光視野。可見轉(zhuǎn)染效率大于９０％??（ｘ２００）〇??由于本慢病毒具有ＣＭＶ啟動的ＥＧＦＰ基因，因此我們使用倍比稀法轉(zhuǎn)染２９３Ｔ細(xì)胞檢測病毒滴度。將三種慢病毒液分別稀釋１０倍、１００倍１０００倍、１００００倍后在９６孔板侵染２９３Ｔ細(xì)胞后７２ｈ，熒光顯微鏡下計ＥＧＦＰ陽性細(xì)胞個數(shù)，計算慢病毒滴度，得到慢病毒載體原液的滴度約ｌｘｌ〇８ＴＵ／ｍｌ?（圖?４Ａ－Ｄ）。??


本文編號：3107022