發(fā)布時(shí)間：2021-02-06 05:42

　　腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤之一。目前其發(fā)病率和死亡率都逐年升高。晚期腎癌治療手段有限、療效欠佳,主要的原因是其對(duì)放化療、免疫內(nèi)分泌治療等輔助治療均不十分敏感,靶向治療也僅在少數(shù)患者有部分作用。目前中晚期腎癌占大多數(shù),且術(shù)后常發(fā)生腎癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,因此研究腎癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制,同時(shí)尋求有效地抑制腎癌、改善其化療耐藥的現(xiàn)狀有十分重要的意義。microRNA （miR）是近些年來(lái)的研究熱點(diǎn),它是一種非編碼的小分子單鏈RNA。不具備開(kāi)放閱讀框架,并不真正有效地表達(dá)蛋白,但它可以有效地調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)。其主要的方法是通過(guò)其種子區(qū)與特異性靶向基因的mRNA的3’UTR相結(jié)合,誘導(dǎo)靶基因mRNA水平下調(diào)或使其翻譯抑制,進(jìn)而調(diào)控目的基因表達(dá)。目前越來(lái)越多的研究表明miR表達(dá)的異常是許多腫瘤共同的特征,它在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。miR-381和miR-424也不例外,盡管目前對(duì)miR-381和miR-424研究相比較少,但它們對(duì)多種腫瘤的影響很明確。miR在腎癌中的功能研究取得了一些進(jìn)展,但腎癌中miR表達(dá)、功能及調(diào)節(jié)是相當(dāng)復(fù)雜的,目前miR-381和miR-424在腎癌中研究尚未見(jiàn)報(bào)道。我... 

【文章來(lái)源】：中南大學(xué)湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：142 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
符號(hào)說(shuō)明
前言
第一章 MIR-381和MIR-424在腎癌中表達(dá)特點(diǎn)及其靶基因分析
    1. 材料與設(shè)備
        1.1 細(xì)胞
        1.2 主要試劑
        1.3 主要設(shè)備和耗材
    2. 方法
        2.1 生物信息學(xué)分析
        2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.3 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
        2.4 MIR-381和MIR-424模擬物（MIMIC）的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
            2.4.1 miR-381和miR-424 mimic的制備
            2.4.2 細(xì)胞準(zhǔn)備
            2.4.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染模型物和對(duì)照核苷酸
        2.5 REAL TIME PCR
            2.5.1 細(xì)胞總RNA提取
            2.5.2 提取細(xì)胞小RNA（使用miR提取試劑盒）
            2.5.3 RNA濃度檢測(cè)
            2.5.4 RNA逆轉(zhuǎn)錄為CDNA
            2.5.5 Real time PCR檢測(cè)
        2.6 WESTERN BLOT實(shí)驗(yàn)
            2.6.1 細(xì)胞總蛋白的提取
            2.6.2 樣本蛋白含量檢測(cè)
            2.6.3 SDS-PAGE凝膠電泳
            2.6.4 轉(zhuǎn)膜
            2.6.5 封閉、抗體孵育和顯色
            2.6.6 凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果
        2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因分析
            2.7.1 實(shí)驗(yàn)分組：本實(shí)驗(yàn)分為如下各組分別轉(zhuǎn)染：實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、無(wú)義序列組（miR-NC）、轉(zhuǎn)染miR-381組和miR-424組
            2.7.2 WEE1（野生型）熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建
            2.7.3 WEE1突變體熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建
            2.7.4 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)miR-381和miR-424對(duì)靶基因WEE1的直接調(diào)控作用
    3. 結(jié)果
        3.1 MIR-381和MIR-424靶基因的生物信息學(xué)分析
        3.2 MIR-381和MIR-424與靶基因的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析
        3.3 MIR瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率測(cè)定
        3.4 MIR-381和MIR-424及其靶基因WEE1的表達(dá)
        3.5 腎癌細(xì)胞株中WEE1蛋白的表達(dá)及其與MIR-381和MIR-424表達(dá)水平的相關(guān)分析
        3.6 熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)分析MIR-381和MIR-424與WEE1靶向關(guān)系
    4 討論
    5 小結(jié)
第二章 MIR-381和MIR-424對(duì)腎癌細(xì)胞株細(xì)胞生物學(xué)功能影響及其機(jī)制研究
    1 材料
        1.1 細(xì)胞株
        1.2 主要試劑
        1.3 主要設(shè)備
    2 方法
        2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
        2.3 MIR-381和MIR-424模擬物（MIMIC）的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
            2.3.1 miR-381和miR-424 mimic的制備
            2.3.2 細(xì)胞準(zhǔn)備
            2.3.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染模型物和對(duì)照核苷酸
        2.4 MIR-381和MIR-424對(duì)786-0、ACHN和HK-2細(xì)胞的MTT抑制實(shí)驗(yàn)
        2.5 細(xì)胞周期的檢測(cè)
        2.6 細(xì)胞凋亡分析
        2.7 熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)CASPASE3/7酶的活性
        2.8 WESTERN BLOT實(shí)驗(yàn)
            2.8.1 細(xì)胞總蛋白的提取
            2.8.2 樣本蛋白含量檢測(cè)
            2.8.3 SDS-PAGE凝膠電泳
            2.8.4 轉(zhuǎn)膜
            2.8.5 封閉、抗體孵育和顯色
            2.8.6 凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果
    3 結(jié)果
        3.1 MTT法檢測(cè)在不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染MIR-381組和MIR-424對(duì)腎癌細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞的生存率的影響
        3.2 CASPASE-3/7活性檢測(cè)分析在不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染MIR-381和MIR-424對(duì)腎癌細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞的CASPASE-3/7活性的影響
        3.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)分析MIR-381和MIR-424對(duì)腎癌細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的影響
        3.4 MIR-381和MIR-424對(duì)腎癌細(xì)胞786-0細(xì)胞周期的影響
        3.5 MIR-381和MIR-424對(duì)腎癌細(xì)胞影響的機(jī)制分析
            3.5.1 過(guò)表達(dá)miR-381和miR-424可抑制靶基因WEE1表達(dá)并促進(jìn)有絲分裂
            3.5.2 過(guò)表達(dá)miR-381和miR-424可抑制細(xì)胞周期“分子開(kāi)關(guān)”Cdc2磷酸化
            3.5.3 過(guò)表達(dá)miR-381和miR-424可調(diào)控細(xì)胞凋亡
            3.5.4 過(guò)表達(dá)miR-381和miR-424抑制Cdc2磷酸化不依賴(lài)于MYT1和Cdc25途徑
    4 討論
    5 小結(jié)
第三章 MIR-381增強(qiáng)5-FU在腎癌細(xì)胞株中化療敏感性及其機(jī)制研究
    1 材料
        1.1 細(xì)胞株
        1.2 主要試劑
        1.3 主要設(shè)備
    2 方法
        2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
        2.3 MIR-381模擬物（MIMIC）的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
            2.3.1 miR-381 mimic的制備
            2.3.2 細(xì)胞準(zhǔn)備
            2.3.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-381 mimics和對(duì)照核苷酸
        2.4 MIR-381和5-FU對(duì)786-0、ACHN和HK-2細(xì)胞的MTT抑制實(shí)驗(yàn)
            2.4.1 操作步驟
        2.5 WEE1 SIRNA轉(zhuǎn)染和回復(fù)實(shí)驗(yàn)
        2.6 細(xì)胞周期的檢測(cè)
        2.7 流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡分析
        2.8 熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)CASPASE3/7酶的活性
        2.9 WESTERN BLOT實(shí)驗(yàn)
            2.9.1 細(xì)胞總蛋白的提取
            2.9.2 樣本蛋白含量檢測(cè)
            2.9.3 SDS-PAGE凝膠電泳
            2.9.4 轉(zhuǎn)膜
            2.9.5 封閉、抗體孵育和顯色
            2.9.6 凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果
    3 結(jié)果
        3.1 MTT法檢測(cè)在不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染MIR-381對(duì)不同的5-FU濃度作用下的腎癌細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞的生存率的影響
            3.1.1 轉(zhuǎn)染miR-381對(duì)不同的5-FU濃度作用下上述細(xì)胞的的生存率影響
            3.1.2 聯(lián)合應(yīng)用5-FU和轉(zhuǎn)染miR-381在不同時(shí)間點(diǎn)上述細(xì)胞的的生存率影響
            3.1.3 轉(zhuǎn)染miR-381明顯下調(diào)786-0細(xì)胞5-FU的IC50（半抑制濃度）
        3.2. IR-381和5-FU對(duì)腎癌細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞的CASPASE-3/7活性的影響
        3.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)分析MIR-381和5-FU對(duì)786-0細(xì)胞凋亡的影響
        3.4 MIR-381和5-FU對(duì)腎癌細(xì)胞786-0細(xì)胞周期的影響
        3.5 WEE1回復(fù)實(shí)驗(yàn)及MIR-381增敏5-FU的機(jī)制
    4 討論
    5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間主要研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]細(xì)胞周期中G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)的研究進(jìn)展[J]. 舒麗娟.  中國(guó)醫(yī)學(xué)工程. 2012(07)
[2]miRNA調(diào)控EMT與口腔癌化療耐藥關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 張斌,黃洪章.  中國(guó)口腔頜面外科雜志. 2011(05)
[3]多基因遺傳性腫瘤不同階段轉(zhuǎn)錄組學(xué)調(diào)控規(guī)律及其分子機(jī)制[J]. 李夏雨,沈守榮,武明花,李小玲,熊煒,盧建紅,周鳴,馬健,向娟娟,曾朝陽(yáng),向波,周艷宏,肖嵐,周厚德,范松青,李桂源.  中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2011(07)
[4]轉(zhuǎn)移性腎癌藥物靶向治療的研究進(jìn)展[J]. 穆家貴,王春陽(yáng),倪少濱.  中華臨床醫(yī)師雜志(電子版). 2011(11)
[5]WEE1與肝癌的關(guān)系[J]. 呂慧,楊玉秀,張立達(dá),白陽(yáng)秋.  世界華人消化雜志. 2011(14)
[6]miRNA與干細(xì)胞的生物學(xué)行為[J]. 張自強(qiáng),劉玉梅,鄧雯,呂瓊霞.  中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù). 2011(10)
[7]IL-2聯(lián)合5-氟尿嘧啶治療晚期腎癌50例療效觀察[J]. 鄒火生,黃裕清,李健,黃敏志.  昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào). 2010(12)
[8]胃癌與癌旁組織miRNA差異表達(dá)譜的研究[J]. 張岱,王振寧,羅陽(yáng),徐巖,劉彥山,楊威,張學(xué).  醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志. 2010 (04)
[9]miRNA介導(dǎo)腫瘤生物學(xué)行為改變的研究進(jìn)展[J]. 陳勇,左靜,劉巍.  中國(guó)腫瘤生物治療雜志. 2010(01)
[10]外周血miRNA作為腫瘤標(biāo)志物的研究進(jìn)展[J]. 萬(wàn)菁.  腫瘤. 2009(06)



本文編號(hào)：3020250