背景腹膜透析（peritoneal dialysis,PD）是終末期腎臟疾病腎臟替代治療方式之一。但是長期暴露于非生理性的腹透液可引起腹膜組織發(fā)生纖維化（peritoneal fibrosis,PF）,最終導(dǎo)致超濾衰竭。腹透液中所含的高濃度葡萄糖是腹膜病變的重要始動(dòng)和促進(jìn)因素。高糖環(huán)境下,腹膜間皮細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞因子及趨化因子,在腹膜炎癥及纖維化過程中有重要作用。高遷移率蛋白B1（high mobility group B1,HMGB1）是一種廣泛存在于真核細(xì)胞的核內(nèi)因子,同時(shí)也是一種重要的炎癥介質(zhì),與腹膜炎癥發(fā)生密切相關(guān)。目的本課題重點(diǎn)探究內(nèi)源性的HMGB1在高糖介導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的地位,明確HMGB1參與腹膜間皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的可能機(jī)制。方法使用人腹膜間皮細(xì)胞系HMrSV5作為研究對象。通過體外細(xì)胞培養(yǎng),觀察高糖環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)HMGB1的定位變化;檢測細(xì)胞在高糖以及重組HMGB1蛋白刺激條件下細(xì)胞炎癥因子表達(dá)變化,并使用小干擾RNA沉默間皮細(xì)胞內(nèi)HMGB1,檢測HMGB1沉默后細(xì)胞在高糖環(huán)境下炎癥因子的表達(dá)變化;最后,檢測HMGB1刺激體系中腹膜間皮細(xì)胞內(nèi)MAPK信號通路... 

【文章來源】：上海交通大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

光鏡下間皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，細(xì)胞呈集落樣生長，融合后呈鋪路石狀

1.3.2 高濃度葡萄糖可導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞內(nèi) HMGB1 表達(dá)減少細(xì)胞內(nèi)的 HMGB1 通常完全位于細(xì)胞核內(nèi)，但在某些刺激因素的作用下，細(xì)胞核內(nèi)的 HMGB1 可從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移出來。為觀察高糖刺激條件下腹膜間皮細(xì)胞內(nèi)HMGB1 的表達(dá)變化，我們使用不同濃度（84mM、138mM、236mM）的高葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)間皮細(xì)胞。高糖刺激 48 小時(shí)后，用 Western Blot 檢測細(xì)胞內(nèi) HMGB1 的表達(dá)。如圖 3 所示，隨著葡萄糖濃度的增加，細(xì)胞內(nèi) HMGB1 的表達(dá)逐漸減少。其中葡萄糖濃度為 236mM 的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的間皮細(xì)胞胞內(nèi) HMGB1 含量下降最明顯，因此選取 236mM 的培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時(shí)間，以觀察胞內(nèi) HMGB1 的含量的時(shí)間變化。結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，間皮細(xì)胞內(nèi) HMGB1 水平隨之遞減（圖 3）。同時(shí)，如此高濃度的葡萄糖必然伴隨著高滲透壓，為驗(yàn)證高糖刺激條件下腹膜間皮圖 2. HMrSV5 細(xì)胞同時(shí)表達(dá)上皮細(xì)胞的標(biāo)志蛋白 Cytokeratin-18, E-cadherin 以及間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白 Vimentin

1.3.3 高濃度葡萄糖刺激下腹膜間皮細(xì)胞核內(nèi) HMGB1 含量減少而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)HMGB1 表達(dá)增加為進(jìn)一步觀察高糖對腹膜間皮細(xì)胞 HMGB1 的表達(dá)的影響，我們進(jìn)行免疫熒實(shí)驗(yàn)對 HMGB1 的細(xì)胞定位進(jìn)行直接的觀察。之前的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的 HMGB1葡萄糖濃度為 236mM 的高糖培養(yǎng)基中 48 小時(shí) HMGB1 含量有明顯下降，因此選該濃度及時(shí)間點(diǎn)對細(xì)胞內(nèi) HMGB1 的定位進(jìn)行免疫熒光染色，同濃度的甘露醇溶作為滲透壓對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖組的腹膜間皮細(xì)胞核內(nèi) HMGB1 熒光密度明顯降，伴隨著細(xì)胞質(zhì)內(nèi) HMGB1 的熒光密度增加，而滲透壓對照組和空白對照組圖 3. 不同濃度的高糖培養(yǎng)基（84mM、138mM、236mM）培養(yǎng)細(xì)胞 48 小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi) HM達(dá)下降，且呈濃度依賴性（上）；腹膜間皮細(xì)胞在含葡萄糖 236mM 的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng) 06h、12h、24h、48h，細(xì)胞內(nèi) HMGB1 含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而下降（中）；含 236mM 的葡培養(yǎng)細(xì)胞 48h，同濃度的甘露醇作為滲透壓對照，高濃度的甘露醇不會(huì)引起細(xì)胞內(nèi) HM表達(dá)下降（下）


本文編號：2971137