目的本研究探討晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）對腎小管上皮細胞（TECs）自噬-溶酶體系統(tǒng)的影響,及其是否通過與RAGE受體的相互作用引發(fā)氧化應激而造成溶酶體損傷,為糖尿病腎病的治療提供新思路。方法AGE-BSA（100μg/ml）刺激HK-2細胞12h后,加用或不加用溶酶體抑制劑用蛋白免疫印跡和免疫熒光檢測LC3-II轉化,研究AGEs對腎小管上皮細胞自噬活性的影響;運用免疫熒光共標記觀察LAMP1和LC3-II共定位,檢測AGEs對腎小管上皮細胞自噬泡與溶酶體融合的影響。AGE-BSA（100μg/ml）刺激HK-2細胞6、12、24h后,運用組織蛋白酶B（CB）、D、L試劑盒分別檢測AGEs對HK-2細胞溶酶體組織蛋白酶的活性;免疫熒光和流式細胞術觀察示蹤紅（TLR）熒光和DQ-卵清蛋白熒光,檢測AGEs對腎小管上皮細胞溶酶體酸化程度和溶酶體消化功能的影響;運用免疫熒光共標記觀察LAMP1和CB熒光,檢測AGEs對腎小管上皮細胞溶酶體完整性（溶酶體膜通透化LMP）的影響。AGE-BSA（100μg/ml）刺激HK-2細胞,免疫熒光和流式細胞術觀察阻斷AGEs與抗體結合或抗氧化劑預處理... 

【文章來源】：暨南大學廣東省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

自噬通路動態(tài)流程示意圖（摘自：JohansenT,etal.Autophagy,2011;7(3):279-96.）

酶和溶酶體膜的共定位情況來評價溶酶體膜通透。未受刺激的HK-2細胞（0h）在顯示出規(guī)則的繞核分布的顆粒狀CB的紅色熒光，但是AGE-BSA分別刺激6h，12h，24h后，CB的光點變得分散而不規(guī)則，提示CB從溶酶體中漏出到了胞漿(圖3.3A,B)。進一步來看CB從溶酶體中的漏出和溶酶體膜通透的關系，免疫熒光雙標記溶酶體膜蛋白LAMP-1及溶酶體酶CB，對照組腎小管上皮細胞內(nèi)LAMP1光點規(guī)則繞核分布于胞漿中，而且大部分與CB熒光共定位。AGE-BSA刺激后溶酶體膜蛋白LAMP1在細胞內(nèi)分布不規(guī)則，聚集呈粗大成團狀分布，組織蛋白酶CB和LAMP1沒有明顯的共定位，CB散布于LAMP1外，不管是用LAMP1變化還是CB變化所提示的發(fā)生LMP的細胞占總的HK-2細胞的百分比隨著AGE-BSA作用時間的延長而增加，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義，P < 0.01（圖3.3A, B

45圖 4.1 抗 RAGE 抗體或抗氧化劑預處理對 AGE-BSA 刺激后 HK-2 細胞溶酶體酸化程度的影響(A) 熒光顯微鏡觀察經(jīng)過抗 RAGE 抗體、NAC 或 catalase (CAT)預處理后，暴露于 Co-BSA或 AGE-BSA 的 HK-2 細胞示蹤紅熒光； (B)流式細胞術檢測示蹤紅熒光信號和平均熒光強度，細胞分組處理同（A） 注：比例尺，20 μm. *P < 0.05，**P < 0.01.


本文編號：2899077