目的 糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是繼發(fā)于糖尿病的一種微血管并發(fā)癥,它占全球范圍內(nèi)終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)的40%以上,是糖尿病患者死亡的重要原因。有研究表明,細胞焦亡參與了糖尿病及其并發(fā)癥糖尿病心肌病的發(fā)病過程中。而在感染性炎癥和胃癌中發(fā)生的細胞焦亡是由Gasdermin家族蛋白介導的一種炎癥性程序性細胞死亡形式。Gasdermin E(GSDME)在腎臟組織中高表達,細胞焦亡是否參與了糖尿病腎病的發(fā)病過程,Gasdermin E是否影響糖尿病腎病中腎臟細胞焦亡尚未見報道,本研究旨在明確GSDME、GSDME-N、caspase-3、p17、caspase-1、p20、IL-1β以及m IL-1β在糖尿病腎病中的表達情況和相互作用,探究caspase-3裂解的GSDME誘導的細胞焦亡在糖尿病腎病發(fā)病過程中的作用,以期為DN的診療、病情監(jiān)測提供新的靶標。方法 1.一次性腹腔大劑量注射鏈脲佐菌素(1%STZ,65 mg/kg)構(gòu)建SD大鼠1型糖尿病腎病動物模型,檢測對照組(Ctrl組)大鼠和糖尿病腎病組(DN組)大鼠的血糖、體重、24 h尿量、尿糖和24 h尿蛋白;2.光學顯微鏡下觀察蘇木精-伊紅(HE)和糖原(PAS)染色后腎臟組織結(jié)構(gòu)的病理變化;3.Western Blot方法檢測GSDME、GSDME-N、caspase-3、p17、caspase-1、p20、IL-1β以及m IL-1β在Ctrl組和DN組大鼠12周、16周、20周腎臟組織中的蛋白表達水平;免疫組織化學染色檢測Ctrl組和DN組大鼠12周、16周、20周腎臟組織中GSDME、caspase-3、caspase-1以及m IL-1β的蛋白表達水平;4.ELISA方法檢測Ctrl組大鼠和DN組大鼠12周、16周、20周靜脈血中m IL-1β的蛋白濃度;5.TUNEL染色檢測Ctrl組大鼠和DN組大鼠12周、16周、20周腎臟組織中腎臟組織中焦亡細胞的陽性率;6.相差顯微鏡觀察高糖刺激的人腎小管上皮細胞(HK2細胞)和大鼠腎小球系膜細胞(RGMCs細胞)的形態(tài)變化;7.HK2細胞和RGMCs細胞經(jīng)高糖刺激0、12、24、36、48 h,Real-Time PCR方法檢測GSDME、caspase-3、caspase-1以及IL-1β的核酸表達水平;Western Blot方法檢測GSDME、GSDME-N、caspase-3、p17、caspase-1、p20、IL-1β以及m IL-1β的蛋白表達水平;ELISA方法檢測高糖刺激不同時間點的細胞培養(yǎng)上清液中m IL-1β的蛋白濃度;8.GSDME-si RNA、caspase-3-si RNA和caspase-1-si RNA干擾后高糖刺激48 h,Western Blot方法檢測GSDME、GSDME-N、caspase-3、p17、caspase-1、p20、IL-1β以及m IL-1β的蛋白表達水平;ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清液中m IL-1β的蛋白濃度。結(jié)果 1.成功構(gòu)建SD大鼠1型糖尿病腎病動物模型:DN組大鼠隨機血糖高于16.7m M,可見“多尿”癥狀。DN組大鼠隨機血糖濃度和24 h尿量明顯高于Ctrl組大鼠,STZ注射8周后24 h尿蛋白明顯升高,而體重明顯低于Ctrl組大鼠;2.PAS染色結(jié)果表明,與Ctrl組相比DN組大鼠腎臟系膜擴張、細胞外基質(zhì)積聚;HE染色結(jié)果表明,DN組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)紊亂、腎小管肥大和間質(zhì)損傷;3.Western Blot方法檢測發(fā)現(xiàn),與Ctrl組相比DN組大鼠腎臟中caspase-3的活化體p17的蛋白表達水平呈時間依賴性顯著升高,20周達到最高;GSDME的N末端裂解片段GSDME-N的表達在16周有所增加,在20周有顯著增加;caspase-1的活化體p20的蛋白表達水平呈時間依賴性升高,20周達到最高;m IL-1β的蛋白表達水平在12周時顯著升高,在16周和20周時明顯降低。免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn),與Ctrl組相比DN大鼠腎組織中GSDME,caspase-3和caspase-1蛋白表達均增高,m IL-1β的蛋白表達水平在12周時顯著升高,隨后隨時間的延長在16周和20周時降低;ELISA檢測結(jié)果顯示,DN組大鼠相較于Ctrl組大鼠16周和20周靜脈血中m IL-1β的蛋白濃度明顯增加;4.TUNEL染色結(jié)果顯示,DN組大鼠20周腎臟組織中TUNEL陽性細胞數(shù)目增加;5.相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示,高糖刺激48 h后與對照組(NG組)相比高糖組(HG組)HK2細胞和RGMCs細胞的形態(tài)明顯腫脹,并在質(zhì)膜上出現(xiàn)特征性大氣泡;6.HK2細胞及RGMCs細胞經(jīng)高糖刺激后caspase-3、GSDME、caspase-1和IL-1β的m RNA表達水平明顯升高;Western Blot檢測結(jié)果顯示HK2細胞及RGMCs細胞經(jīng)高糖刺激后,HG組GSDME-N、p17和p20的蛋白表達水平明顯高于NG組;HG組m IL-1β蛋白表達水平在24 h增加到峰值后開始下降,與此同時相應(yīng)細胞培養(yǎng)上清液中的m IL-1β濃度從36 h開始以時間依賴性的方式增加;7.與NC-si RNA組比,GSDME-si RNA干擾組的細胞內(nèi)m IL-1β的蛋白水平增高,而相應(yīng)的細胞培養(yǎng)上清液中m IL-1β的蛋白濃度降低;8.與NC-si RNA組相比caspase-3和caspase-1雙干擾組中,GSDME-N、caspase-1和p20、caspase-3和p17的蛋白水平顯著降低;細胞內(nèi)m IL-1β的蛋白水平明顯高于NC-si RNA組和caspase-1干擾組,低于caspase-3干擾組;caspase-3和caspase-1雙干擾組中細胞上清液中的m IL-1β濃度均較其他組降低。結(jié)論 1.成功構(gòu)建1型糖尿病腎病SD大鼠動物模型;2.糖尿病腎病中腎臟細胞發(fā)生了細胞焦亡,細胞焦亡引發(fā)m IL-1β的釋放增加在糖尿病腎病的炎性相關(guān)發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用;3.caspase-3裂解GSDME誘發(fā)細胞焦亡同時增加m IL-1β的釋放是糖尿病腎病發(fā)病機制之一。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R587.2;R692.9
【部分圖文】：

天津醫(yī)科大學碩士學位論文圖 1：STZ 誘導的 SD 大鼠 1 型糖尿病腎病動物模型的生物學特征a-b. Ctrl 組大鼠和 DN 組大鼠在 0、4、8、12、16 和 20 周的隨機血糖水平和體重水平；c-e. Ctrl 組大鼠和 DN 組大鼠在 8、12、16 和 20 周尿糖、24 小時尿量和 24 小時尿蛋白水平。結(jié)果用均值±標準差（mean ± SD）表示，n≧5。*P<0.05（與 Ctrl 組比較）。2. 大鼠腎臟組織 PAS 染色和 HE 染色觀察腎臟組織形態(tài)改變大鼠腎臟組織 PAS 染色結(jié)果顯示 DN 組大鼠腎臟組織系膜擴張、局灶性腎小管肥大和細胞外基質(zhì)積聚，而 Ctrl 組大鼠腎臟組織未觀察到這些變化（圖 2a）。另外 HE 染色顯示, 與 Ctrl 組相比 DN 組大鼠腎臟出現(xiàn)了明顯的組織結(jié)構(gòu)紊亂、腎小管肥大和腎小管間質(zhì)損傷（圖 2b）。

2. 大鼠腎臟組織 PAS 染色和 HE 染色觀察腎臟組織形態(tài)改變大鼠腎臟組織 PAS 染色結(jié)果顯示 DN 組大鼠腎臟組織系膜擴張、局灶性腎小管肥大和細胞外基質(zhì)積聚，而 Ctrl 組大鼠腎臟組織未觀察到這些變化（圖 2a）。另外 HE 染色顯示, 與 Ctrl 組相比 DN 組大鼠腎臟出現(xiàn)了明顯的組織結(jié)構(gòu)紊亂、腎小管肥大和腎小管間質(zhì)損傷（圖 2b）。圖 2a：Ctrl 組大鼠和 DN 組大鼠腎臟組織 PAS 染色（左：Ctrl 組；右：DN 組，400×）

Ctrl 組大鼠和 DN 組大鼠靜脈血清中 mIL-1β的濃20 周 DN 組大鼠和 Ctrl 組大鼠血清中 mIL-1β的濃（mean ± SD）表示，n≧5。*P<0.05（與 Ctrl 組組織中免疫組織化學染色檢測 caspase-3 mIL-1β的蛋白表達化學染色測定 DN 模型誘導后 12 周、16 周、20 中 caspase-3、GSDME、caspase-1 和 mIL-1β的蛋 Ctrl 組相比 DN 組大鼠腎臟中 caspase-3 的蛋白。DN 組大鼠腎臟中GSDME的蛋白表達與Ctrl 組 Ctrl 組相比 DN 大鼠腎臟中 caspase-1 的蛋白表達。然而，與 Ctrl 組相比，DN 組大鼠腎臟中 mIL-著升高，隨后隨時間的延長在 16 周和 20 周時降
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本文編號：2894390