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下丘腦室旁核WNT-RAS信號通路對腎臟纖維化調控作用的研究

發(fā)布時間:2020-11-16 18:42
   研究背景:隨著我國經(jīng)濟建設的快速發(fā)展,健康問題也受到越來越多的關注,而慢性腎臟疾病(Chronic kidney disease,CKD)就是其中一個深受關注的焦點。研究顯示慢性腎臟疾病的發(fā)病率逐年升高,而有效的治療手段卻相當匱乏。這一現(xiàn)狀不僅極大的加重了社會及家庭的經(jīng)濟負擔,同時也嚴重的影響了患者的生活品質。研究并解決這一現(xiàn)狀已然成為一個極其迫切的現(xiàn)實問題。研究證實Wnt/β-catenin信號通路和腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system,RAS)均在腎臟纖維化疾病中起著至關重要的作用。同時有研究表明RAS組份中的各種信號分子均受到了 Wnt/β-catenin信號通路的直接調控,如血管緊張素原(Angiotensinogen,AGT),血管緊張素轉化酶1(Angiotensin converting enzyme,ACE-1),血管緊張素 Ⅱ(AngⅡ),血管緊張素Ⅱ的1型受體(AngiotensinⅡ AT1-receptor,AT1R)。在早期的研究中證實,不僅是腎臟局部及循環(huán)中的RAS成分對腎臟纖維化的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用,中樞神經(jīng)系統(tǒng)(如下丘腦室旁核,PVN)的RAS也參與了這一過程,并且腎臟局部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間信號調節(jié)和反饋機制的研究也取得了積極的進展。但是PVN的wnt/β-catenin信號通路在腎臟纖維化疾病中可能起到的作用、PVN的wnt/β-catenin信號通路和PVN的RAS是否存在某種關聯(lián)、PVN的wnt/β-catenin信號通路對腎臟局部的wnt/β-catenin信號通路和RAS是否存在關聯(lián)等問題都尚未被闡明。目的:通過阻斷PVN的Wnt/β-catenin信號通路來探究PVN的wnt/β-catenin信號通路在腎臟纖維化疾病中可能起到的作用、PVN的wnt/β-catenin信號通路和PVN的RAS之間可能存在的關聯(lián)、PVN的WNT-RAS信號通路和腎臟局部的WNT-RAS可能存在關聯(lián)等。方法:1、選擇雄性Sprague Dawley(SD)大鼠進行5/6腎切除術(5/6NX),建立腎臟纖維化疾病模型。于造模后第6周稱量大鼠體重,用尾套法測量大鼠血壓,通過剪尾法采集血液并測量血肌酐、尿素氮,使用代謝籠收集24h尿液并檢測24h蛋白尿。根據(jù)檢測結果篩選成模大鼠,進行隨機化分組并通過側腦室注射AAV過表達載體阻斷PVN的Wnt/β-catenin信號通路。2、干預持續(xù)6周時間,處死前測量血壓,稱量體重,收集24h尿液,之后犧牲并采集血液、腦組織及腎臟組織樣本待檢。3、通過western blot和免疫組化方法檢測中樞PVN及腎臟的wnt/β-catenin信號通路和RAS的活化程度。通過western blot及HE,PAS染色評估腎臟纖維化及腎小球硬化損傷程度。結果:1、天狼猩紅和PAS染色結果顯示,5/6NX大鼠和對照組相比出現(xiàn)了明顯的腎臟纖維化及腎小球硬化等病變。2、免疫組化及 western blot 結果顯示,腎臟及 PVN 的 wnt3a、active-β-catenin、AGT、ACE-1、AT1表達水平均顯著上調,提示腎臟和腦內的wnt/β-catenin信號通路及RAS均顯著活化。3、免疫組化及western blot結果顯示,經(jīng)側腦室注射含有目的基因DKK1的AAV過表達載體后腎臟及PVN的wnt/β-catenin信號通路及RAS組分包括wnt3a、active-β-catenin、AGT、ACE-1、AT1表達水平均被顯著抑制,且腎臟纖維化等病理改變顯著改善。結論:1.腎臟纖維化改變不僅和腎內WNT-RAS的異;罨嚓P,同時還受中樞WNT-RAS的調控。2.在腎臟纖維疾病中腦內wnt/β-catenin信號通路調控了 RAS的表達,同時腎臟局部的WNT-RAS信號通路受到腦內WNT-RAS信號通路的密切調控。
【學位單位】:南方醫(yī)科大學
【學位級別】:碩士
【學位年份】:2019
【中圖分類】:R692
【部分圖文】:

過表達,載體,免疫熒光


同時免疫熒光共定位結果顯示DKK1陽性細胞和GFP陽性細胞之間有??良好的相關性,這些結果都證實了?AAV-DKK1過表達載體在大鼠PVN中成功過表??達(如圖1-1所示)。??GFP?DKK1?Merge?Magnify??icvacsF??圖1-1.?AAV-DKKl過表達載體在PVN中成功過表達。實驗中使用了特異性抗體GFP?(綠??色)和DKK1?(紅色)對PVN組織進行免疫熒光共染,白色箭頭指示的是GFP和DKK1共染呈??陽性的細胞(黃色)。放大倍數(shù)X?100;比例尺=200?uni。??Figure?1-]:?Adeno-associated?virus?vector?successfully?over-expresses?target?gene?DKK1?in?PVN.??Co-localization?of?GFP?and?DKK1?in?PVN?was?performed?by?double?staining?with?the?antibody?of??against?GFP?(green)?and?DKK1?(red).?The?white?arrow?indicates?positive?cells?with?co-localization??of?GFP?and?DKK1?(yellow).?Magnification?x?100;?scale?bar?=200|.im.??2.2?PVN的ffnt/P-catenin信號通路在5/6NX大鼠中顯著活化

信號通路,側腦室注射,大鼠


catenin的表達水平顯著升高,這也預示著PVN的Wnt/?0?-catenin信號通路與??腎臟纖維化病變密切相關。同時,側腦室注射AAV-DKK1可以顯著的抑制Wnt/P-??catenin信號通路的異;罨ㄈ鐖D1-2所示)。??A?ICVaCSF?ICV?0KK1?n??M?Sham?+5/6NX?+5/6NX?°?°?w1f3a??tao-i?E33?aolrv^?-cs^ran??!?*??wnt3a?.?|?100-?*?參??r??active-3?*?.?廣?+?+???catenm?"?^?^??r?n?^??ICVaCSF?ICV0KK1?f?p^73??Sham?4-5/6NX?^/6NX??0J'????___________?_______________?*〇?Q?wXw-;??ww?^?!i?oe-?m????ac,,ve^??-m?-?f?04'?丁??—?ji?〇,^?m??e.attin?f?〇Jkmd???^??E.二.一一一#a?y?y??圖1-2.?PVN的Wnt/?P?-catenin信號通路在5/6NX大鼠中顯著活化

柱狀圖,側腦室注射,表達水平,大鼠


ACE-1、ATI表達水平顯著升高。同時,通過側腦室注射AAV-DDK1阻斷PVN的??wnt/P-catenin信號通路可以顯著的抑制PVN的RAS活性,這一結果提示PVN??的wnt/?P?-catenin信號通路對PVN的RSA存在緊密的調控作用(如圖1-3所。??ICV?aCSF?ICV?DKK1??Sham?+5/6NX?+5/6NX??A?B??AGT?m?AGT??150-?£23?AC£??|?〇?ATI??.??? ̄?u??-?I?100-?^?*??l1?ii??ATI?>??#??ICV?aCSF?ICV?DKK1??Sham?+5/6NX?+5/6NX??C?D?1?a?agt??勺??£23?ATI??is?.?i?i??...?it?-而?6義?il??—__丨_丨丨丨丨酬釀>?|<?mi?Hi?m??P-dctin?1?_N_MMMMRMMHMHMMRMNiHRRMRHHHlNNHHMHRP;?^?^??圖1-3.?PVN的RAS表達水平在5/6NX大鼠中顯著上調,側腦室注射AAV-DKKl可以顯著地??抑制這一改變。(A)免疫組化檢測AGT,?ACE-1和ATI在PVN的表達水平。放大倍數(shù)X?100;??比例尺=200?um。(B)免疫組化的統(tǒng)計結果的柱狀圖。(C)?Western?blot檢測AGT和AT1在??PVN的表達水平。(D)?Western?blot統(tǒng)計結果的柱狀圖。每組中n=4/5,?*P<0.?05?i,s?sham??組
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