發(fā)布時間：2020-11-09 21:34

　　 第一部分 人HuR蛋白在腎小管上皮細胞EMT過程中的作用研究背景近年來,由于亞洲地區(qū)糖尿病人群基數(shù)持續(xù)增多,糖尿病腎病(Diabetic nephropathy, DN)逐漸成為終末期腎臟疾病(End stage renal disease, ESRD)最常見的原因之一。根據(jù)美國腎臟病數(shù)據(jù)庫(USRDS)的統(tǒng)計,美國人群的糖尿病腎病發(fā)病率近年來維持在較穩(wěn)定的水平,可能是由于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI或ARB)類藥物的廣泛使用,但是進展至ESRD的速度卻絲毫沒有放緩。由于國情不同以及發(fā)病機制的復(fù)雜性,各種作用相互交織,其病因以及發(fā)病機制尚未完全闡明,最終均以不可逆的腎臟纖維化進展至尿毒癥為結(jié)局。上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象(Epithelial to Mesenchymal Transition, EMT)的發(fā)生與特定環(huán)境下某些生物學(xué)特征的改變密切有關(guān),外部環(huán)境發(fā)生改變時,人體內(nèi)特定程序?qū)㈦S之發(fā)生轉(zhuǎn)化,使某些上皮細胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的間質(zhì)細胞,其生物學(xué)效應(yīng)也多種多樣,如在纖維化疾病,慢性炎癥過程,癌癥異位轉(zhuǎn)移,胚胎的發(fā)育以及組織重構(gòu)等等都發(fā)揮了重要作用。因為發(fā)生EMT過程中步驟繁多卻十分有序,其過程可以在某種程度上受到外界的高度調(diào)節(jié),同時產(chǎn)生多種致病因子,反之,許多生長因子或致纖維化因子均能誘導(dǎo)其發(fā)生。RNA結(jié)合蛋白HuR是胚胎致死異常視覺家族(ELAV)中的一員,在許多疾病中廣泛表達,由于其在腫瘤和炎癥中的地位和作用得到更多關(guān)注。研究表明HuR與腫瘤發(fā)生過程中的許多特征密切相關(guān),如原癌基因的激活,細胞周期調(diào)控失控導(dǎo)致的細胞不良增殖,細胞外基質(zhì)成分和各種致纖維化因子的異常增多,最終導(dǎo)致了器官纖維化。而在EMT的發(fā)生發(fā)展中同樣存在如間充質(zhì)基因的激活,細胞的異常增殖,生長因子的過分增多等特征。本研究將通過HuR蛋白與糖尿病腎病EMT特征的關(guān)系來探討轉(zhuǎn)錄后調(diào)控糖尿病腎病中的作用,從而闡明HuR蛋白極可能是影響EMT發(fā)展以及糖尿病腎病進展的重要因素。研究方法(1)選取病理診斷為糖尿病腎病的腎臟病理組織20例,正常腎臟組織10例。入院后所有患者簽署腎穿刺活檢知情同意書,并經(jīng)過山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。同時,選取雄性SD大鼠,分為正常組和糖尿病腎病組,使用鏈脲佐菌素(STZ)方法建立糖尿病腎病模型。免疫組織化學(xué)法檢測及對比RNA結(jié)合蛋白HuR在正常和糖尿病腎病患者腎活檢組織,以及大鼠腎臟中的表達變化,特別是胞漿胞核的變化。同時觀察上皮表型蛋白E-cadherin, Cytokeratin及間質(zhì)表型蛋白a-SMA, Vimentin的表達變化。(2)體外實驗：體外培養(yǎng)永生化的腎小管上皮細胞HK-2分別在正常對照組,高糖培養(yǎng)組,及等滲對照組培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng),并且與第24小時,48小時,72小時收獲細胞進行指標(biāo)檢測。分別提取細胞胞漿,胞核以及全細胞中蛋白以用Westernblot方法檢測檢測高糖刺激前后細胞中HuR蛋白的變化及EMT相關(guān)表型蛋白表達含量,采用細胞免疫熒光檢測高糖刺激前后HuR蛋白的移位變化。(3)免疫沉淀法檢測RNA結(jié)合蛋白HuR與變化糖尿病腎病EMT相關(guān)蛋白c-fos,TGF-β1, Snail, CTGF蛋白的結(jié)合能力。根據(jù)人HuR mRNA基因編碼區(qū)序列,利用計算機輔助設(shè)計軟件設(shè)計4條針對HuR的siRNA (參照 http:// www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html),選擇出一條干擾效率最強的的shRNA轉(zhuǎn)染至HK-2細胞。(4)測定HuR干擾前后HuR與各因子mRNA結(jié)合水平,和對EMT相關(guān)蛋白及表型蛋白表達水平的影響。通過觀察高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化時相關(guān)因子及RNA結(jié)合蛋白HuR的變化,探討轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在糖尿病腎病小管間質(zhì)纖維化中的作用。研究結(jié)果(1)免疫組化結(jié)果顯示,在正常人及正常大鼠腎組織部分腎小管細胞胞核中有HuR蛋白的表達,細胞漿中鮮有表達。在糖尿病腎病組織中,與正常組相比,人及大鼠DN組織中可見HuR在胞核及胞漿的表達均有明顯增加。細胞免疫熒光及、Vesternblot結(jié)果顯示,高糖刺激后HuR總蛋白較正常組及高糖組有所增加(p0.05),胞核中蛋白表達無顯著差異,胞漿中HuR在刺激48小時后有顯著升高,但在72小時后水平有所恢復(fù)。(2) Westernblot結(jié)果顯示,上皮細胞表型蛋白E-cadherin, Cytokeratin表達下降,而間質(zhì)表型蛋白a-SMA, Vimentin有所上升,而高糖誘導(dǎo)的c-fos,TGF-β1, Snail,CTGF蛋白表達水平均有不同程度的升高,免疫沉淀法顯示四種蛋白與HuR蛋白結(jié)合能力各不相同。(3)行HuR干擾后,與高糖組相比,免疫沉淀法顯示HuR與EMT各功能蛋白mRNA結(jié)合水平顯著下降；Westernblot結(jié)果顯示E-cadherin水平有所上升(P0.05),而CK表達水平無明顯變化,a-SMA與Vim蛋白表達水平下降(P0.05)。EMT功能蛋白TGF-β1, Snail, CTGF均有不同程度的表達下降,c-fos由于其特性的不同其表達在高糖刺激前后及HuR干擾前后上升或下降的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)論由于RNA結(jié)合蛋白HuR的特殊生物學(xué)結(jié)構(gòu)近特性,使其可能通過穩(wěn)定EMT相關(guān)基因的mRNA,從而使其表達增多而在器官纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。HuR及EMT的相關(guān)表型蛋白在糖尿病腎病早期表達明顯增高,干擾HuR后功能蛋白水平顯著下調(diào),提示HuR是否可以作為DN早期的診斷指標(biāo)并且可能通過降低各種致纖維化因子的轉(zhuǎn)錄后水平來影響DN中小管上皮細胞EMT的發(fā)生。當(dāng)然,HuR在糖尿病腎病中的具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚待進一步研究,但HuR蛋白有望成為即腫瘤之后糖尿病腎病診斷及疾病進展的一種理想標(biāo)志物,從而為器官纖維化的治療提供新靶點,為糖尿病腎病患者治療決策提供理論依據(jù)。第二部分 HuR在AngII刺激系膜細胞增殖中的影響研究背景腎小球系膜細胞(Human mesangial cells,HMCs)異常增殖作為一個顯著特征可以存在于不同病理類型的慢性腎臟病中,這種異常增殖常常受到腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活的影響,在多種慢性腎臟病損傷以及疾病進展中起到重要作用,如在糖尿病腎病,IgA腎病,狼瘡性腎炎中常常作為判斷活動性病變的首要評分標(biāo)準(zhǔn)。血管緊張素Ⅱ (AngⅡ)是RAAS中最主要的效應(yīng)因子,其不僅可以影響腎小球血流動力學(xué),更會刺激腎小球中的固有細胞引發(fā)異常增殖過程,并伴隨過多細胞周期調(diào)節(jié)因子的產(chǎn)生。CyclinD1是最主要的調(diào)節(jié)G1/S期的周期蛋白,是反映細胞增殖狀態(tài)的一個良好指標(biāo)。HuR屬ELAV家族中一員,可調(diào)節(jié)mRNAs穩(wěn)定性及翻譯,在不同細胞中起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的作用。正常的細胞增殖需要CyclinD1的表達,但是CyclinD1得過度表達會引起細胞過度增殖作最終導(dǎo)致細胞內(nèi)外基質(zhì)的大量產(chǎn)生及最終腎小球纖維化等后果。觀察人抗原R(human antigen R, HuR)在血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ, AngⅡ)激活下人系膜細胞(HMC)增殖中的作用,探討轉(zhuǎn)錄后調(diào)控對慢性腎臟病細胞異常增殖的影響。因Cyclin D1 mRNA在3’UTR含有許多的AREs序列,可以被含有AREs-binding的結(jié)合蛋白如HuR蛋白結(jié)合,而RNA結(jié)合蛋白HuR在AngⅡ刺激下的系膜細胞增殖中的作用仍不清楚。因此,本研究將通過觀察HuR蛋白表達變化,進一步闡述在慢性腎臟病中的作為初始環(huán)節(jié)的系膜細胞增殖過程中是否存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的機制,從而使我們更好的認識慢性腎臟病的疾病進程,為延緩進入終末期腎臟病提供理論依據(jù)。研究方法(1)體內(nèi)部分：選取正常人群以及不同水平系膜細胞增殖的慢性腎臟病如糖尿病腎病,狼瘡性腎病,IgA腎病,紫癜性腎炎,原發(fā)性膜性腎病患者腎臟活檢組織各5例,調(diào)閱病歷,排除血漿AngⅡ水平在正常值范圍內(nèi)的患者,被確診為以上疾病的患者血漿AngⅡ水平均高于正常值(請見表2)。血漿AngⅡ測量均在省立醫(yī)院檢驗科采用放射免疫法統(tǒng)一測量。測得的患者24小時尿蛋白定量均在0.5g以上,血肌酐水平均在正常范圍內(nèi)(山東省立醫(yī)院質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)為40-135μmol/L)。免疫組織化學(xué)方法檢測在各種系膜增殖性疾病中系膜細胞胞漿胞核人HuR蛋白的表達水平變化。(2)體外部分：a.配制濃度為100ng/ml的AngⅡ加入培養(yǎng)液中刺激人系膜細胞,分別觀察0小時、3小時、12小時、18小時、24小時時所需指標(biāo)的水平變化。細胞免疫化學(xué)方法檢測HuR蛋白在各個時間點的表達變化；b. Westernb lot方法測定AngⅡ刺激HMC 0小時、3小時、12小時、18小時、24小時時胞漿HuR水平,以及HuR干擾前后CyclinDl mRNA及蛋白表達水平；c.流式細胞儀檢測HuR干擾前后對AngⅡ誘導(dǎo)HMC細胞周期的影響；d.放線菌素D法檢測AngⅡ刺激前后CyclinD1 mRNA穩(wěn)定性的變化；e.CCK-8檢測系膜細胞增殖水平；f.免疫沉淀法測定AngⅡ刺激前后HuR與CyclinDl mRNA結(jié)合水平。研究結(jié)果(1)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：正常人腎小球中有部分系膜細胞,細胞核中有少量HuR蛋白表達。而在糖尿病腎病,狼瘡性腎炎全部組織中,與正常組相比,HuR蛋白在細胞漿中的含量顯著增加。在系膜細胞輕度增殖的IgA腎病和紫癜性腎炎中,只有部分HuR蛋白在胞漿中表達增多。而在原發(fā)性膜性腎病患者系膜細胞中,HuR水平無顯著變化。(2)細胞免疫組化學(xué)結(jié)果顯示,與對照組相比,Ang刺激組可見HuR從胞核轉(zhuǎn)移到胞質(zhì),其中在3小時和6小時變化胞漿中增加最為顯著,之后水平逐漸恢復(fù)；相應(yīng)的使用Westernblot方法觀察HuR蛋白表達水平出現(xiàn)類似的變化趨勢,可見第3小時和第6小時細胞胞漿中HuR蛋白的表達增加,細胞核中一過性減少,而總蛋白水平變化無統(tǒng)計學(xué)差異。(3)流式細胞儀分析經(jīng)AngⅡ刺激后G1期細胞百分數(shù)均減少,S期百分數(shù)增加,表明系膜細胞進入增殖期。相應(yīng)地,RT-PCR及Westemblot結(jié)果顯示,AngⅡ誘導(dǎo)的CyclinD1 mRNA水平顯著增加(P0.05),蛋白水平明顯增高(P0.05)。免疫沉淀法顯示AngⅡ刺激后的HuR 與 CyclinD1 mRNA結(jié)合能力顯著升高(P0.05)。經(jīng)過AngⅡ刺激后的CyclinD1 mRNA穩(wěn)定性明顯延長,由正常的9.13小時升至20.34小時(P0.05)。(4)在系膜細胞中對HuRmRNA進行沉默,qRT-PCR檢測siHuR干擾后CyclinD1mRNA水平變化無統(tǒng)計學(xué)差異,但是Westernblot結(jié)果顯示CyclinD1蛋白表達水平顯著下降(P0.05)。流式細胞儀分析顯示HuR干擾后G1期有所上升,S期和M期均有下降；免疫沉淀法顯示HuR干擾后HuR與CyclinDl mRNA結(jié)合能力顯著降低(P0.05)。HuR干擾后,CyclinD1 mRNA穩(wěn)定性有所下降,但未恢復(fù)正常水平,CCK-8檢測到其增殖數(shù)量相比于AngⅡ刺激組顯著減少。研究結(jié)論HuR與CyclinD1蛋白表達水平在病理性系膜細胞增殖發(fā)生時表達明顯增高,特別是在血管緊張素AngⅡ刺激時增殖現(xiàn)象明顯。具體表現(xiàn)為CyclinD1蛋白表達水平顯著增高,并且伴隨HuR蛋白從細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移至細胞漿內(nèi)的一過性遷移性表現(xiàn)。在此過程中,我們推測是由于CyclinD1 mRNA的穩(wěn)定性顯著延長,導(dǎo)致其蛋白表達增多,從而造成系膜細胞的過度增生。而干擾HuR后CyclinD1 mRNA穩(wěn)定性顯著減少,蛋白水平下降,提示HuR可能通過降低CyclinD1轉(zhuǎn)錄后水平來影響腎臟細胞異常增殖的發(fā)生。如在此基礎(chǔ)上進行相應(yīng)的干預(yù),進一步探討抑制HuR對慢性腎臟病是否具有保護效應(yīng),一方面有助于幫助我們深入理解慢性腎臟病發(fā)生的病理生理機制,同時為尋求更可行、有效和安全的干預(yù)手段進行有意的嘗試。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R692.9;R587.2
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
符號說明
前言
第一部分
    背景
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
第二部分
    背景
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
第一部分 附圖
第二部分 附圖
附表
參考文獻
致謝
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