目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最重要的并發(fā)癥之一,也是造成慢性腎病(chronic kidney disease,CKD)的主要病因,嚴重影響患者的生活質量及生存率,因此,探究DN發(fā)病機制尤為重要。腎小管間質纖維化(tubulointerstistisis fibrosis,TIF)是CKD的重要標志。上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在TIF的進展中起中心作用。Toll樣受體2(Toll like receptors 2,TLR2)是Toll樣受體家族(Toll like receptors,TLRs)重要一員,參與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展,那么,TLR2是否參與DN腎小管EMT呢?因此,本研究以DN患者腎活檢標本、人腎小管上皮細胞HK2及TLR2敲除小鼠糖尿病模型為研究對象,探究TLR2在DN腎小管EMT中的作用。方法:1.以DN患者腎穿組織、腎腫瘤瘤旁正常對照腎臟組織為研究對象,用免疫組織化學(Immunohistochemistry,IHC)技術檢測TLR2、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及上皮型鈣粘蛋白(epithelia cadherin,E-cadherin)在腎組織中的表達水平,并分析TLR2與α-SMA、E-cadherin的相關性。2.探討高糖能否引起HK2發(fā)生EMT及TLR2的激活:以HK2為研究對象,高糖(30 mM)培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h收集細胞,Western Blot檢測TLR2、α-SMA及E-cadherin蛋白的表達。3.探討TLR2是否參與了高糖誘導的HK2發(fā)生EMT及轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的分泌:正常培養(yǎng)并處于良好生長狀態(tài)HK2隨機分為對照組(control)、高糖刺激組(High Glucose,HG)、高糖刺激+空載shRNA轉染組(HG+shNC)、高糖刺激+shTLR2轉染組(HG+shTLR2),Western Blot技術檢測α-SMA及E-cadherin蛋白的表達;同時收集細胞培養(yǎng)上清液,運用ELISA技術檢測HK2培養(yǎng)上清中TGF-β1蛋白的含量。4.探討抑制TLR2的表達對DN小鼠腎小管EMT的影響:以C57BL/6J野生型和同背景的TLR2~(-/-)小鼠為研究對象,用鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導糖尿病模型。將小鼠分為control組、WT+STZ組、TLR2~(-/-)+STZ組。提取小鼠鼠尾DNA鑒定小鼠基因型;取部分腎皮質提取蛋白,Western Blot檢測α-SMA及E-cadherin蛋白的表達。5.探討抑制TLR2的表達對DN小鼠腎小管細胞外基質沉積的影響:取部分小鼠腎皮質制作冰凍切片,免疫熒光(Immunofluorescent,IF)檢測纖維連接蛋白(fibronectin,FN)的表達,部分腎組織制作石蠟切片,免疫組織化學(Immunohistochemistry,IHC)檢測Ⅲ型膠原(CollagenⅢ)的表達;Masson染色技術檢測腎間質纖維化。6.探討抑制TLR2的表達對DN小鼠腎小管TGF-β1的影響:取小鼠腎組織石蠟切片,免疫組化檢測TGF-β1的表達。結果:1.在DN時,腎小管上皮細胞TLR2高表達且與其EMT呈顯著相關性:IHC結果顯示:TLR2、α-SMA蛋白主要定位于腎小管上皮細胞胞質;E-cadherin主要定位于腎小管上皮細胞胞質和細胞膜。與control組相比,DN患者腎穿組織腎小管上皮細胞中TLR2、α-SMA蛋白表達明顯上調,E-cadherin蛋白表達明顯下調,TLR2與α-SMA表達呈明顯正相關(P0.05,r=0.5188),TLR2與E-cadherin表達呈明顯負相關(P0.05,r=﹣0.6625)。2.高糖可以引起腎小管上皮細胞HK2發(fā)生EMT及TLR2蛋白表達上調:Western Blot結果顯示,與0 h相比,高糖刺激后,TLR2、α-SMA蛋白表達水平升高,E-cadherin蛋白表達水平下降。3.TLR2參與了高糖誘導的HK2發(fā)生EMT和TGF-β1的分泌:Western Blot結果顯示:與HG+shNC組相比,HG+shTLR2組α-SMA表達下降,且E-cadherin表達上升;同樣ELISA結果顯示:HG組TGF-β1的分泌明顯高于control組,而與HG+shNC組相比,敲低TLR2表達能夠減低高糖誘導的TGF-β1的分泌。4.敲除TLR2基因能夠改善糖尿病小鼠腎小管上皮細胞的EMT:PCR結果顯示:TLR2~(-/-)小鼠鼠尾組織TLR2 wild-DNA呈陰性而TLR2mutant-DNA呈陽性。Western Blot結果顯示:與control組相比,WT+STZ組α-SMA表達上升,且E-cadherin表達下降,表明小鼠腎小管上皮細胞發(fā)生了EMT;但與WT+STZ組相比,TLR2~(-/-)+STZ組α-SMA表達下降,E-cadherin表達上升。5.敲除TLR2基因能夠抑制糖尿病鼠腎小管細胞外基質沉積:IF、IHC和Masson結果顯示:與control組相比,WT+STZ組FN和CollagenⅢ表達上調且藍染的膠原纖維增多;而TLR2~(-/-)+STZ組FN和CollagenⅢ表達下降且藍染的膠原纖維減少。6.敲除TLR2基因能夠減少糖尿病鼠腎小管細胞TGF-β1的表達:免疫組化結果顯示:TGF-β1蛋白主要定位于腎小管上皮細胞胞質,與control組相比,WT+STZ組TGF-β1表達上升;但與WT+STZ組相比,TLR2~(-/-)+STZ組TGF-β1表達下降。結論:在DN發(fā)病過程中,TLR2表達上調,且可能通過增加TGF-β1的表達參與DN時腎小管上皮細胞EMT。
【學位單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R692.9;R587.2
【部分圖文】：

20圖 1A 免疫組化檢測 DN 腎穿標本和對照組中 TLR2、α-SMA 和E-cadherin 蛋白的表達(Bar:50 μm)Fig.1AThe expression of TLR2, α-SMAand E-cadherin in renopuncturetissues of DN patients and control group. (Bar:50 μm)

stern Blot 檢測各組細胞 α-SMA、E-cadhe Western Blot analysis of α-SMA，E-cadher(*P<0.05 vs oh group)TLR2 參與了高糖誘導的 HK2 發(fā)生 EMT Blot 結果顯示，shTLR2 可以敲低 TLR2 蛋HG 組 α-SMA 表達明顯升高，E-cadherin 達后，即 HG+shTLR2 組 α-SMA 表達下 3A)。ELISA 結果顯示，與 control 組相比高，同時與 HG+shNC 組相比，HG+ shTLB)。

B ELISA 檢測細胞培養(yǎng)上清中 TGF-β1 的ontents of TGF-β1 in the supernatant of cedetermined by ELISA.05 vs control group;#P<0.05 vs HG+shNCR2能夠改善DN時腎小管上皮細胞的EM示：TLR2-/-小鼠鼠尾組織TLR2 wild-DN性(圖4A)。Western Blot結果顯示，與A表達上升，且E-cadherin表達下降，表MT；但與WT+STZ組相比，TLR2-/-+ST表達上升(圖4B)。
【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

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本文編號：2870341