背景前列腺癌(Prostate cancer;PCa)是最常見的惡性腫瘤之一,在男性癌癥相關死亡率中占第六位。據(jù)WHO全球腫瘤流行病學統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,全球男性癌癥發(fā)病率排名,PCa僅次于肺癌位居第2位。在中國,生活習慣、飲食結構西方化、人口老齡化使得PCa的發(fā)病率快速逐年上升。目前PCa臨床可行前列腺根治性切除術;晚期以內(nèi)分泌治療為主,可行睪丸切除術,配合激素阻斷治療。中位緩解期為18-24個月,多進展為去勢抵抗性前列腺癌(castrate-resistant prostate cancer;CRPC),具有高增殖性、高侵襲力,目前臨床治療方法多不理想。腫瘤細胞能夠對幾乎所有的靶點治療產(chǎn)生適應性抵抗。這是在醫(yī)療領域中一直存在的挑戰(zhàn)。轉移性前列腺癌(Metastatic prostate cancer;mPCa)目前是無法治愈和致命的。自從1941年起由Huggins和Hodges進行的外科或醫(yī)學閹割證明雄激素剝奪抑制前列腺癌,目前雄激素剝奪療法(androgen-deprivation therapy;ADT)仍然是mPCa治療的主要手段。ADT作用是限制雄激素的可用性和控制雄激素核異位。雄性激素受體(The androgen receptor,AR)調節(jié)劑作為一種轉錄因子通過與其配體結合域(LBD)結合,指導特異蛋白質的合成及細胞的生長和分化。盡管超過80%的mPCa患者最初對ADT有反應,但最終發(fā)展成CRPC。在這個階段,病人被考慮雄激素耗盡,因此PCa可能獨立于AR信號生長。因此研究CRPC的發(fā)生機制并從中找到治療靶標已成為目前研究CRPC的熱點。染色體不穩(wěn)定性是癌癥的標志之一,與腫瘤轉移有著很大的相關性。SWI/SNF(Switch in mating type/sucrose non fermentation)復合物是染色質重塑復合物中的一種,由 BRG1/BRM,INI1(SMARCB1、BAF47、SNF5),BAF155,BAF170,BAF180和BAF250A亞基組成。染色質重塑復合物SWI/SNF是發(fā)育基因表達的重要調控因子。SWI/SNF復合物在各種細胞生物學過程中起重要作用,如細胞周期、腫瘤形成和細胞凋亡。SWI/SNF丟失誘發(fā)的癌癥發(fā)展,與DNA修復、轉錄、細胞周期調控和核小體定位有關。BRG1基因相關因子155(BRG1-associated factor 155,BAF155)是 SWI/SNF 復合物中的一員,BAF155是在細胞周期蛋白E復合物中被發(fā)現(xiàn)的,并能被其相關激酶磷酸化。由于BAF155位于染色體3p221.31上,其中包括一些腫瘤抑制基因,如FUS1和SEM3B,因此BAF155的缺失可能有助于腫瘤的發(fā)展,但BAF155在人類前列腺癌PC3細胞中的功能尚未得到完全明確。Med19是Mediator家族的重要成員,在基因轉錄過程中發(fā)揮重要功能,敲除Med19亞基使Mediator復合物的穩(wěn)定性降低,抑制RNA聚合酶Ⅱ末端磷酸化,從而使轉錄水平的降低,因此沉默其表達能抑制腫瘤生長和擴散。已有研究表明,中介體復合物亞基19(Mediator Complex Subunit 19;Med 19)參與了多種腫瘤的進展過程,過度表達起促進作用。Med19通過調節(jié)CBFA2T3/HEB的表達促進乳腺癌細胞的增殖。Med19能促進非小細胞肺癌細胞增殖遷移能力同時還可增強化療藥物Cisplatin的敏感性。Med19被miR-101-3p/miR-422a靶向,通過調控EGFR/MEK/ERK信號通路促進乳腺癌進展,下調HMGB1信號轉導誘導自噬增強阿霉素的化學敏感性。癌細胞浸潤前沿的腫瘤-宿主相互作用是一個重要的界面,它包含了癌細胞去分化的動態(tài)過程,稱為上皮-間充質轉化(Epithelial-to-mysenchymal transition;EMT)。EMT 可以通過“腫瘤萌芽”形式進行組織學鑒定,這一特征對于顯示浸潤性腫瘤生長模式的腫瘤具有高度的特異性。重要的是,腫瘤萌芽和腫瘤邊界形態(tài)作為額外的預后因素引起了人們的極大興趣,并且也被國際抗癌聯(lián)盟所認可。腫瘤轉移起初需要細胞侵襲,而侵襲是由EMT啟動的。然而,Med19在前列腺癌中的作用尚不明確,因此本研究試圖闡明Med19在前列腺癌中,是如何調控EMT啟動調節(jié)前列腺癌細胞增殖遷移以及凋亡作用的。本文主要進行BAF155和Med19在人前列腺癌細胞中的生物學作用及分子機制研究:1、為了探討在前列腺癌細胞中增殖、分化與轉移中BAF155發(fā)揮的作用,本研究利用蛋白質印跡法分析了 BAF155蛋白在PC3中表達水平;2、在PC3、Hela和SNUC2B細胞篩選BAF155蛋白表達水平較高的細胞系,使用慢病毒BAF155-shRNA和BAF155-siRNA分別對BAF155基因進行過表達和干擾,檢測BAF155mRNA和蛋白表達情況以及細胞系的增殖情況、侵襲能力和細胞凋亡,驗證前列腺癌細胞生物學行為是否受BAF155的調控,為前列腺癌形成的分子機制和后續(xù)治療的研究奠定基礎;3、在PC3細胞中,研究敲除Med19-siRNA后細胞敲除效率,Medl9如何調控前列腺癌細胞的增殖遷移作用,Med19是如何影響EMT啟動抑制腫瘤細胞增殖遷移作用。研究內(nèi)容分為以下兩大部分:第一部分BAF155在人類前列腺癌PC3細胞中的功能的研究研究目的本研究探討在人類PC3細胞中BAF155的作用,并進一步解釋BAF155表達缺失的作用機制。從而為低分化、非雄激素依賴的前列腺癌的治療尋找更好的治療靶點。研究方法1.用免疫印跡方法檢測BAF155在PC3細胞中表達情況。2.將野生型BAF155的全長編碼序列亞克隆至載體pcDNA3.1(+)中,構建BAF155(pc-BAF155)的超表達載體,并進行測序鑒定。3.將 pcDNA3.1、pc-BAF155、pc-BAF155+si-BAF155 分別轉染到細胞中。利用定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,QRT-PCR)檢測BAF155的mRNA表達水平,并用免疫印跡檢測上述轉染BAF155蛋白效率。4.將上述轉染BAF155因子的PC3細胞分別用MTT法,凋亡檢測和遷移實驗檢測細胞的活力,凋亡和遷移能力。5.最后用Western blot檢測p16和磷脂酰肌醇-3-羥激酶(Phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3 K)/蛋白激酶 B(Protein kinase B,AKT)和 WNT/β-catenin通路涉及的相關蛋白的表達水平。6.數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,本研究所有實驗均重復3次,實驗所得數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示,P0.05時具有統(tǒng)計學意義。研究結果1.通過研究發(fā)現(xiàn),在Hela細胞中BAF155高表達,BRG1低表達;在PC3細胞中BAF155表達缺失和BRG1低表達;SNUC2B細胞BRG1高表達,但BAF155不表達。2.在PC3細胞中,過表達BAF155能夠增加BAF155轉錄翻譯過表達,但是敲除BAF155后,BAF155表達下降。3.過表達BAF155明顯抑制PC3細胞的增殖(抑制率為50%)和遷移能力(遷移率抑制率56%),并促進PC3細胞的凋亡(凋亡率28%)(P0.05),再向細胞中轉染si-BAF155后,細胞的遷移能力又出現(xiàn)增加。4.對蛋白表達水平進一步研究表明,細胞中轉染pc-BAF155后p16的表達水平顯著增加(增長倍數(shù)為2.3)(P0.05),過表達BAF155能夠顯著抑制p/t-PI3K、p/t-AKT、Wnt3a、β-catenin 和 Wnt5a 的表達水平(P0.05)(抑制倍數(shù)分別為0.78、0.45、0.67、0.63、0.52),從而抑制PC3細胞的增殖,促進凋亡。當再向細胞中轉染siRNA-BAF155后,這些蛋白的表達水平又恢復到正常。研究結論在PC3細胞中BAF155具有抑癌作用。BAF155可抑制PC3細胞的增殖和遷移能力,抑制后PC3細胞又重新具有增殖遷移能力。BAF155通過上調p16的表達,下調PI3K/AKT水平,并使WNT/β-catenin通路失活,最終誘導PC3細胞凋亡。本研究結果顯示BAF155可以作為一個有效靶點進行深入研究。研究意義本研究首次研究BAF155在前列腺癌細胞中抑癌作用,并發(fā)現(xiàn)在PC3細胞中,BAF155可以上調p16,下調PI3K/AKT水平,并使WNT/β-catenin通路失活,最終誘導PC3細胞凋亡。第二部分沉默人類前列腺癌PC3細胞中的Med19基因的基礎研究研究目的探討Med19對人前列腺癌PC3細胞侵襲遷移能力的影響及其在EMT轉化過程中的作用機制。研究方法1.采用針對Med 19的siRNA慢病毒載體感染PC3細胞。2.應用QRT-PCR和蛋白質印跡方法(Western blot,WB)檢測Med 19-siRNA感染組小干擾 RNA(Small interfering RNA,siRNA)與空載組(scRNA)Medl9 基因轉錄翻譯情況。3.采用Boyden小室侵襲實驗、劃痕實驗檢測感染后PC3細胞侵襲、遷移能力變化。4.采用 QRT-PCR 檢測感染后 PC3 細胞 E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、ZEB2、Snail-1 和 Snail-2 mRNA 的表達。研究結果1.PC3-Med19-si/sc細胞的建立與表征。在慢病毒感染和FACS分類后,通過熒光顯微鏡下測定GFP的表達來證實其轉導效率。所有細胞的GFP 陽性率均大于95%。2.Med 19-siRNA慢病毒感染PC3細胞后,實驗組Med 19 mRNA表達水平比空載組明顯降低(基因轉錄率低18%),差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)3.Med 19-siRNA慢病毒感染Med19蛋白表達水平比空載組明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。4.Boyden小室侵襲實驗和劃痕實驗顯示感染組細胞侵襲、遷移能力明顯減弱(P0.01)。PC3-Med 19-si 細胞侵襲率為19.71 ±4.00%,而對照 PC3-Med 19-sc細胞的侵襲率為32.27±3.72%(*P0.05)。PC3-Med 19-si細胞劃痕修復區(qū)域比率顯著小于對照細胞(70.83 ±9.37%v.s.87.33±4.63%,**P0.01)。5.感染組 N-Cadherin、Vimentin、ZEB2、Snail-1 和 Snail-2 表達降低,E-Cadherin表達升高,在PC3-Med19-sc組和PC3-Med19-si組相比下面蛋白相對灰度均值:N-Cadherin:1±0.12756、0.45586±0.05091;E-Cadherin:1±0.07178、1.78180±0.14847;Vimentin:1±0.07177、0.46652士0.03348;ZEB2:1±0.04083、0.43528±0.04862;Snail-1:1±0.12756、0.58777±0.02400;Snail-2:1±0.04830、0.57435±0.04786。因素方差分析結果顯示p0.05。研究結論沉默Med 19基因可通過抑制EMT中的相關基因從而降低人前列腺癌PC3細胞的轉移能力。研究創(chuàng)新性通過本研究首次報道Med19抑制EMT及相關基因的表達,從而前列腺癌細胞增殖遷移能力得到抑制。揭示了 Med19在前列腺癌中重要作用。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R737.25
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
符號說明（按字母順序排列）
第一部分 BAF155在人類前列腺癌PC3細胞中的功能的研究
    前言
    材料與方法
    結果
    討論
    結論
    附錄
第二部分 沉默人類前列腺癌PC3細胞中的Med19基因的基礎研究
    前言
    材料與方法
    結果
    討論
    結論
    附錄
參考文獻
綜述 綜合評估晚期前列腺癌患者治療靶點
    參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表的學術論文和參加科研情況
學位論文評閱及答辯情況表
English paper （Ⅰ）
English paper （Ⅱ）

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本文編號：2868013