【摘要】：背景和目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者較為常見的一種并發(fā)癥,也是引起終末期腎臟病(end-stage renal disease,ESRD)的重要原因之一。隨著人們對糖尿病腎病的研究及認識,現(xiàn)在普遍認為糖尿病腎病是一種慢性炎癥性疾病,長期微炎癥狀態(tài)使得腎臟腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)的改變,進而引發(fā)微量蛋白尿乃至大量蛋白尿�，F(xiàn)在不少學者認為巨噬細胞在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。Bruton酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase,Btk)是一種非受體型酪氨酸激酶,屬于Tec激酶家族。近期研究表明,Btk是Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)及Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)等信號通路的重要的信號分子,參與并增強TLR信號轉(zhuǎn)導并最終激活NF-κB和MAPKs信號通路,繼而啟動炎癥反應。同時,Btk僅表達于除T淋巴細胞及組織漿細胞的髓系細胞,較TLR信號通路更有優(yōu)勢,本研究探討B(tài)tk在糖尿病腎臟巨噬細胞激活及腎臟炎癥中的作用及分子機制,為糖尿病腎病的治療提供新的思路及措施。方法:第一部分:提取小鼠骨髓來源的巨噬細胞,培養(yǎng)成熟后采用細胞流式技術(shù)對巨噬細胞進行鑒定。采用CCK-8法檢測不同濃度的Btk抑制劑PCI-32765對巨噬細胞活性的影響,接著采用Western blot法檢測在不同時間點和不同抑制劑濃度下p-Btk的相對表達量以優(yōu)化實驗條件。把巨噬細胞分為:低糖組(LG),抑制劑對照組(LG+PCI-32765),高糖組(HG),抑制劑組(HG+PCI-32765),刺激相應時間后收集細胞和上清,提取細胞m RNA及總蛋白。Transwell法觀察巨噬細胞的趨化功能;ELISA法檢測上清中IL-1β,TNF-α和MCP-1濃度;實時定量PCR檢測IL-1β,TNF-α和MCP-1m RNA表達水平;Western blot檢測i NOS,Btk,p-Btk,ERK,p-ERK,JNK,p-JNK,p38,pp38,NF-κB p65,p-NF-κB p65,IκB,p-IκB等蛋白的表達;激光共聚焦法檢測巨噬細胞的激活及NF-κB p65核轉(zhuǎn)移。第二部分:選取Btk全髓系敲除小鼠及同背景野生型小鼠各14只作為研究對象,糖尿病組注射50mg/kg.d STZ連續(xù)5天,一周后檢測各小鼠尾尖血糖,血糖≥16.7mmol/L則視為造模成功。該實驗分為四組,分別為:野生型小鼠7只作為正常對照組(WT,n=7),糖尿病小鼠組(Diabetic,n=7),Btk敲基因小鼠組(Btk-/-,n=7)和Btk敲基因糖尿病小鼠組(Btk-/-diabetic,n=7)。12周后檢測各小鼠體重、血糖、腎重,收集血、24小時尿及腎臟標本。酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測小鼠24小時尿蛋白排泄率;光鏡觀察小鼠腎臟病理變化;免疫組化方法檢測IL-1β,MCP-1,激光共聚焦法檢測CD68等;實時定量PCR檢測IL-1β,MCP-1和TNF-α的表達;Western blot檢測蛋白IL-1β,i NOS,TNF-α,Btk,p-Btk,ERK,p-ERK,JNK,p-JNK,p38,pp38,NF-κB p65,p-NF-κB p65的表達。結(jié)果:第一部分:細胞流式結(jié)果顯示F4/80和CD11b雙陽性的細胞占細胞總數(shù)的94.5%,細胞的純度及成熟度均符合實驗要求;實驗條件優(yōu)化后選擇高糖的濃度為25mmol/L,PCI-32765的干預濃度為10-6mmol/L;Transwell趨化實驗結(jié)果顯示高糖刺激的巨噬細胞趨化的數(shù)目明顯高于低糖組(P0.05),PCI-32765干預后細胞趨化數(shù)目較高糖組明顯下降(P0.05);實時定量PCR結(jié)果顯示,高糖組細胞IL-1β,TNF-α和MCP-1m RNA水平較低糖組細胞明顯上升(P0.05),抑制劑組與高糖組相比,三者的m RNA水平明顯下調(diào)(P0.05);ELISA結(jié)果顯示,高糖組細胞上清中IL-1β,TNF-α和MCP-1濃度較低糖組明顯升高(P0.05),與高糖組相比,抑制劑組IL-1β,TNF-α和MCP-1濃度明顯下降(P0.05);Western blot結(jié)果顯示,與低糖組相比,蛋白i NOS,p-Btk,p-ERK,p-JNK,pp38,p-NF-κB p65,p-IκB相對表達量明顯升高(P0.05),抑制劑組與高糖組比,i NOS,p-Btk,p-ERK,p-NF-κB p65,p-IκB的表達明顯下降(P0.05),p-ERK,p-JNK的表達未見明顯變化(P0.05);激光共聚焦結(jié)果顯示,高糖組巨噬細胞激活標志蛋白i NOS的表達和NF-κB p65核轉(zhuǎn)移較低糖組明顯升高,與高糖組相比,抑制劑組兩者的表達則有所下降。第二部分:與WT組小鼠相比,糖尿病小鼠血糖、糖化血紅蛋白、腎重/100g體重和24小時尿蛋白排泄率明顯改變(P0.05),與Diabetic組相比,Btk-/-diabetic組24小時尿蛋白排泄率明顯降低(P0.05),血糖、糖化血紅蛋白和腎重/100g體重未發(fā)生明顯改變;光鏡下,Diabetic組小鼠較正常組小鼠腎臟腎小球體積增大,基底膜增厚,系膜細胞增殖,Btk-/-diabetic組小鼠較Diabetic組有所改善;實時定量PCR結(jié)果表明:Diabetic小鼠腎臟炎癥因子較正常組表達明顯升高(P0.05),Btk缺失后小鼠腎臟炎癥水平較糖尿病小鼠明顯下降(P0.05);免疫組化和激光共聚焦提示Diabetic小鼠腎臟巨噬細胞浸潤明顯增加,隨著Btk敲除,腎臟巨噬細胞浸潤明顯減少;Western blot結(jié)果顯示蛋白p-Btk,p-ERK,p-JNK,p-NF-κB p65,p-IκB在Diabetic組小鼠腎臟的表達較正常小鼠明顯升高(P0.05),較Diabetic組小鼠,Btk-/-diabetic小鼠腎臟中這些蛋白的表達明顯下降。結(jié)論:1在高糖刺激下,骨髓來源巨噬細胞激活,細胞內(nèi)p-Btk,p-ERK,p-JNK,pp38,p-NF-κB p65,p-IκB表達上調(diào),炎癥因子IL-1β,MCP-1,TNF-α表達增加;Btk敲除后抑制MAPK以及NF-κB信號通路激活,下調(diào)巨噬細胞炎癥因子的表達。2在動物實驗中,糖尿病小鼠腎臟p-Btk表達明顯升高,24小時尿蛋白排泄率升高,腎小球出現(xiàn)肥大,基底膜增厚,外基質(zhì)沉積等病理改變,除此之外腎臟炎癥及巨噬細胞浸潤激活增加,Btk敲除后該現(xiàn)象有所改善,提示Btk可能參與了糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展;3糖尿病小鼠腎組織,p-Btk,p-ERK,p-JNK,pp38,p-NF-κB p65,p-IκB的表達明顯上調(diào),炎癥因子IL-1β,TNF-α和MCP-1合成增加,Btk敲除后下調(diào)MAPK,NF-κB信號通路以及炎癥因子的表達,提示Btk致糖尿病腎損傷發(fā)生的機制可能與MAPK以及NF-κB信號通路激活有關(guān);
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R587.2;R692.9
【圖文】：

32髓來源巨噬細胞的純度檢測糖對 BMMs 活化的影響圖 2 結(jié)果所示，采用 Western blot 法檢測不同葡萄糖濃度對巨噬細胞其中使用甘露醇將各組滲透壓調(diào)整至一致。當葡萄糖終濃度為 30mm胞活化的標志蛋白 iNOS 表達達到高峰(P<0.05)，在此高糖濃度下蛋生磷酸化(P<0.05)，因此在后續(xù)的實驗中，葡萄糖終濃度定為 30mm

同濃度高糖對 BMMs 活化的影響糖濃度為 5mmol/L 相比，*P<0.05制劑 PCI-32765 對 BMMs 活性的影響CK-8 法檢測不同濃度的 Btk 抑制劑 PCI-32765 對巨噬細胞活性的見當 PCI-32765 的濃度在 10-8~10-5mM 范圍時，PCI-32765 對巨噬，當濃度達到 10-4mM 時，PCI-32765 對高糖刺激的巨噬細胞的活)。

不同濃度高糖對 BMMs 活化的影響萄糖濃度為 5mmol/L 相比，*P<0.05抑制劑 PCI-32765 對 BMMs 活性的影響 CCK-8 法檢測不同濃度的 Btk 抑制劑 PCI-32765 對巨噬細胞活性的影見當 PCI-32765 的濃度在 10-8~10-5mM 范圍時，PCI-32765 對巨噬細，當濃度達到 10-4mM 時，PCI-32765 對高糖刺激的巨噬細胞的活性05)。

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本文編號：2781366