【摘要】：目的:1.研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSC)對(duì)環(huán)磷酰胺(CTX)導(dǎo)致的大鼠肝、腎損傷的治療作用。2.探索在UC-MSC治療CTX導(dǎo)致的腎損傷中經(jīng)典Wnt/b-catenin信號(hào)通路所發(fā)揮的作用。方法:1.UC-MSC的分離、培養(yǎng)和鑒定從新鮮臍帶中分離并培養(yǎng)貼壁細(xì)胞至第4代,顯微鏡下觀察其形態(tài),流式細(xì)胞術(shù)鑒定其細(xì)胞表型,并鑒定其成骨、成脂、成軟骨等誘導(dǎo)分化能力。2.環(huán)磷酰胺導(dǎo)致大鼠肝、腎損傷模型的建立并鑒定將12只SD大鼠隨機(jī)分為Control組和CTX組,CTX組大鼠腹腔注射CTX(200mg/Kg),對(duì)照組以相同的方式注射等量PBS。24小時(shí)后處死,檢測(cè)以下指標(biāo)確定造模是否成功。2.1檢測(cè)血清中生化指標(biāo)改變外周血離心(3500g,20min)取上清,檢測(cè)血清中谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、血尿素氮(BUN)和肌酐(creatinine)的表達(dá)。2.2檢測(cè)肝、腎組織均漿中氧化應(yīng)激損傷指標(biāo):應(yīng)用超聲法將肝、腎組織制成10%的組織均漿,檢測(cè)其中丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、脂質(zhì)過氧化物(LPO)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物(GSH-PX)的表達(dá)。2.3組織病理學(xué)檢查肝、腎組織切片,行HE染色,比較其病理學(xué)改變。3.UC-MSC對(duì)CTX導(dǎo)致的大鼠肝、腎損傷的治療作用的實(shí)驗(yàn)研究將成年雄性SD大鼠隨機(jī)分成Control組、CTX組和CTX+UC-MSC組,將CTX+U-MSC組第1次尾靜脈注射UC-MSC記為實(shí)驗(yàn)第1天(D1)。CTX+UC-MSC組D1、D4、D7、D10 尾靜脈注射 UC-MSC(2X10^6/只),CTX 組和 CTX+UC-MSC 組D3腹腔注射CTX(200mg/kg)。Control組在相同時(shí)間以相同方式注射生理鹽水。在D4、D7、D10、D13每組隨機(jī)選取6只大鼠處死。3.1用化學(xué)分析法檢測(cè)不同組血清中ALT、AST、ALP、TBIL、BUN和肌酐的變化。3.2用生化學(xué)方法檢測(cè)不同組肝、腎組織均漿中MDA、LPO、NO、T-SOD、GSH、GSH-PX 的表達(dá)。3.3檢測(cè)肝、腎組織中凋亡相關(guān)蛋白基因和VEGFA基因表達(dá)從肝、腎組織中提取RNA,并用Real time qPCR法檢測(cè)組織中凋亡相關(guān)蛋白基因(Bax和Bcl-2)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGFA)基因的表達(dá)。3.4病理學(xué)檢查肝、腎組織固定后切片,行HE染色和免疫組化染色(α-SMA和Ki-67染色)。4.Wnt/β-catenin信號(hào)通路在UC-MSC治療CTX導(dǎo)致的大鼠腎損傷中的作用提取腎組織蛋白,Western blot 法檢測(cè)蛋白中 Wnt3、β-catenin、Axin2、occludin、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體1(VEGFR1)和平滑肌肌動(dòng)蛋白α(α-SMA)的表達(dá)。結(jié)果1.UC-MSC的分離、培養(yǎng)和鑒定:臍帶中分離培養(yǎng)的細(xì)胞呈漩渦樣貼壁生長,流式細(xì)胞術(shù)示該細(xì)胞高表達(dá)CD44、CD73、CD90和CD105,低表達(dá)CD34和CD45,該細(xì)胞可向成骨、成脂、成軟骨細(xì)胞特定分化,符合UC-MSC的定義,提示該細(xì)胞為UC-MSC。2.CTX導(dǎo)致大鼠肝、腎損傷模型的建立2.1與Control組相比,CTX組血清中ALT、AST、ALP、TBIL表達(dá)升高(P0.05),說明肝功能受損;BUN和肌酐的表達(dá)均升高(P0.05),這說明腎功能受損。2.2肝、腎組織均漿中,CTX組SOD、GSH和GSH-PX的表達(dá)低于Control組(P0.05),MDA、LPO和NO表達(dá)高于Control組(P0.05),說明肝腎均受到CTX導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷。2.3組織病理學(xué)觀察,CTX誘導(dǎo)的肝臟組織肝索紊亂,肝細(xì)胞基質(zhì)疏松淡染,呈氣球樣變,部分細(xì)胞內(nèi)可見脂肪空泡,有的空泡較大將肝細(xì)胞核擠壓靠近肝細(xì)胞膜呈月牙狀,局部可見炎細(xì)胞浸潤。CTX誘導(dǎo)的腎臟組織可見腎小球壞死,炎細(xì)胞浸潤,出血,周圍腎小管水腫。3.UC-MSC對(duì)CTX導(dǎo)致的大鼠肝、腎損傷的治療作用3.1與CTX組相比,在任意時(shí)間點(diǎn),UC-MSC處理后血清中ALT、AST、ALP、TBIL、BUN和肌酐的表達(dá)均下降(P0.05)。3.2肝、腎組織均漿中,在任意時(shí)間點(diǎn),CTX+UC-MSC組SOD、GSH和GSH-PX的表達(dá)高于CTX組(P0.05),MDA、LPO和NO表達(dá)低于CTX組(P0.05)。3.3 Real-time qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與Control組相比,大鼠注射CTX后,肝、腎組織內(nèi)Bax的mRNA表達(dá)上調(diào),Bcl-2的mRNA表達(dá)下調(diào)(P0.05)。尾靜脈注射UC-MSC后,Bax表達(dá)減少,Bcl-2表達(dá)增加(P0.05)。CTX+UC-MSC組肝、腎組織內(nèi)VEGFA的mRNA表達(dá)遠(yuǎn)高于Control組和CTX組(P0.05)。3.4組織病理學(xué)改變:CTX誘導(dǎo)的肝臟組織肝索紊亂,肝細(xì)胞基質(zhì)疏松淡染,呈氣球樣變。局部可見炎細(xì)胞浸潤。部分細(xì)胞可見脂肪空泡使細(xì)胞核呈月牙狀。UC-MSC預(yù)處理的大鼠肝臟病變程度輕于CTX組。腹腔注射CTX后,CTX+UC-MSC組大鼠肝臟恢復(fù)速度快于CTX組。CTX誘導(dǎo)的腎臟組織可見腎小球壞死,炎細(xì)胞浸潤,出血,周圍腎小管水腫。UC-MSC預(yù)處理的大鼠腎臟病變程度低于CTX組,尾靜脈多次注射UC-MSC可加快腎損傷的恢復(fù)。3.5免疫組化:Control組未見α-SMA+細(xì)胞,CTX注射后,肝臟組織在D4可見散在α-SMA+細(xì)胞,D13時(shí)可見大量α-SMA+細(xì)胞,尾靜脈注射UC-MSC后,肝臟切片α-SMA+細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均低于CTX組。Control組切片發(fā)現(xiàn)Ki-67+細(xì)胞散在分布于血管內(nèi)壁,肝臟組織內(nèi)未發(fā)現(xiàn)Ki-67+細(xì)胞。CTX組肝臟切片在血管附近和肝臟組織內(nèi)可見散在少量Ki-67+細(xì)胞。UC-MSC處理后,Ki-67+細(xì)胞數(shù)量多于CTX組,多分布于肝臟組織內(nèi)和大血管周圍。大鼠腎臟組織中,Control組未見α-SMA+組織,CTX組在D10和D13腎小球內(nèi)可見α-SMA+的纖維化組織,CTX+UC-MSC組內(nèi)α-SMA+組織較CTX組少。在大鼠腎小管周圍,Control組可見少量Ki-67+細(xì)胞,CTX組和CTX+UC-MSC組Ki-67+細(xì)胞數(shù)量增多,且UC-MSC處理后Ki-67+細(xì)胞多于CTX組。4.腎臟組織中,與CTX組相比,CTX+UC-MSC組Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白Wnt3、β-catenin和Axin2蛋白表達(dá)上調(diào),連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)升高,VEGFR1表達(dá)增加,α-SMA+表達(dá)下降。結(jié)論:1.UC-MSC預(yù)處理可減輕CTX導(dǎo)致的大鼠肝、腎損傷,損傷后尾靜脈多次注射UC-MSC可加速損傷的修復(fù);2.UC-MSC治療CTX導(dǎo)致的大鼠腎損傷可能是通過激活組織內(nèi)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R575;R692
【圖文】：

圖１人臍帶間充質(zhì)千細(xì)胞鑒定。Ａ為ｈＵＣ－ＭＳＣ形態(tài)學(xué)表現(xiàn)；Ｂ為流氏細(xì)胞逡逑學(xué)鑒定ｈＵＣ－ＭＳＣ；邋Ｃ為堿性磷酸酶染色；Ｄ為甲苯胺藍(lán)染色；Ｅ為油紅０染色。逡逑

圖２邋ＣＴＸ正常大鼠與注射ＣＴＸ后大鼠大體改變及血清生化指標(biāo)的比較。Ａ逡逑和Ｂ分別為正常大鼠和ＣＴＸ組大鼠；Ｃ為Ｃｏｎｔｒｏｌ組與ＣＴＸ組大鼠體重變化；逡逑Ｄ為兩組大鼠肝臟／體重比率的比較；Ｅ為兩組大鼠腎臟／體重比率的比較；Ｆ－Ｉ依逡逑血ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、ＴＢＩＬ的變化；Ｋ和Ｊ分別表示兩組大逡逑

圖３正常大鼠與ＣＴＸ組大鼠肝腎組織臟內(nèi)氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)的比較。Ａ－Ｆ逡逑表示Ｃｏｎｔｒｏｌ組與ＣＴＸ組大鼠肝臟組織均漿內(nèi)氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)的比較，依次為逡逑ＭＤＡ、ＬＯＰ、ＮＯ、ＳＯＤ、ＧＳＨ邋和邋ＧＳＨ－ＰＸ邋的比較；Ｇ－Ｌ邋表示邋Ａ－Ｆ邋表示邋Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑組與ＣＴＸ組大鼠腎臟組織均漿內(nèi)氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)的比較，依次為ＭＤＡ、ＬＯＰ、逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Human umbilical cord Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells differentiation into nerve-like cells[J];Chinese Medical Journal;2005年23期

本文編號(hào)：2764744