發(fā)布時(shí)間：2020-07-16 16:11

【摘要】：背景和目的膀胱癌(bladder cancer)是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。近年來(lái)在我國(guó)發(fā)病率逐年升高。70~80%膀胱癌患者初次就診時(shí)為非肌浸潤(rùn)性膀胱癌(NMIBC),目前臨床上多采用經(jīng)尿道電切術(shù)(TUR)聯(lián)合膀胱灌注治療,但治療后復(fù)發(fā)率高,且約30%的NMIBC患者術(shù)后發(fā)展成浸潤(rùn)性膀胱癌。因此,探索其發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn),一直是泌尿外科學(xué)者研究膀胱癌的重要課題。我們前期研究發(fā)現(xiàn),膀胱癌患者尿液中1-甲基腺苷(m1A)、1-甲基次黃苷(1-mel)、O6-甲基鳥(niǎo)苷(O6-meG)、N4乙酰胞苷(ac4c)4種修飾核苷水平顯著高于正常人,其中m1A與1-meI聯(lián)合檢測(cè)膀胱癌具有極高的靈敏度(92.45%)及特異度(87.50%),對(duì)膀胱癌患者的早期診斷和監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)具有重要的意義。m1A是由m1A58甲基轉(zhuǎn)移酶催化其tRNA58位的腺苷(A)形成的,該酶由hTrm6p、hTrm61p兩個(gè)亞基組成,其中hTrm61P由TRMT61A基因編碼,是m1A58甲基轉(zhuǎn)移酶的催化亞基。我們后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中hTrm61p mRNA和蛋白表達(dá)較癌旁組織中明顯升高,下調(diào)膀胱癌5637系細(xì)胞株中hTrm61p的表達(dá),細(xì)胞增殖和侵襲能力顯著減弱,凋亡率明顯增加,表明hTrm61p可促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展,但其表達(dá)升高的相關(guān)機(jī)制尚不明確。如能明確hTrm61p調(diào)控的相關(guān)機(jī)制,必將進(jìn)一步明確其在該惡性腫瘤防治中的價(jià)值。核因子-кB(NF-кB),全稱(chēng)核因子活化B細(xì)胞K輕鏈增強(qiáng)子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer ofactivated B cells),是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族,在許多細(xì)胞刺激介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起核心作用,參與多種基因的表達(dá)和調(diào)控,在細(xì)胞凋亡和增殖、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等多種細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。在多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了NF-кB的異常激活,促進(jìn)活化的NF-кB核移位,參與調(diào)控下游靶基因序列,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。NF-кB在腫瘤中的重要作用使其成為了揭示腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展及其調(diào)控的重要環(huán)節(jié),經(jīng)基因庫(kù)反復(fù)對(duì)比查詢(xún),發(fā)現(xiàn)hTrm61p基因啟動(dòng)子區(qū)存在NF-кB結(jié)合位點(diǎn),推測(cè)NF-кB可能對(duì)hTrm61p表達(dá)的調(diào)控有著重要的影響。此外,二者之間的關(guān)系及其具體作用機(jī)制目前國(guó)內(nèi)外未有相關(guān)報(bào)道。本研究旨在前期工作的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步檢測(cè)膀胱癌組織和癌旁組織中hTrm61p和NF-кB的mRNA表達(dá)水平,并進(jìn)行二者的相關(guān)性分析;以不同濃度的NF-кB抑制劑PDTC處理5637細(xì)胞株,觀察細(xì)胞的增殖情況,并檢測(cè)hTrm61p的mRNA和蛋白表達(dá)水平;應(yīng)用免疫熒光方法觀察hTrm61p及NF-кB蛋白在5637細(xì)胞中的定位;最后采用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)5637細(xì)胞中hTrm61p和NF-кB蛋白的結(jié)合情況。通過(guò)本課題的研究,可望獲得NF-кB在人膀胱癌5637細(xì)胞系中對(duì)hTrm61p表達(dá)調(diào)控的直接證據(jù),為進(jìn)一步探索膀胱癌的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)提供了新的理論依據(jù)。方法:1.檢測(cè)hTrm61p及NF-кB mRNA在膀胱癌和癌旁組織中的表達(dá):選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2016年2月-2017年2月行膀胱全切或膀胱次全切病例34例(其中男27例,女7例,年齡33~81歲,中位年齡62歲,低級(jí)別膀胱癌14例,高級(jí)別膀胱癌20例),術(shù)后活檢均確診膀胱尿路上皮癌,分別取癌組織、癌旁5cm外的正常組織,采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)技術(shù)檢測(cè)hTrm61p及NF-кB mRNA在膀胱癌和癌旁組織中的表達(dá),并根據(jù)癌組織中hTrm61p及NF-кB mRNA的表達(dá)量對(duì)二者行相關(guān)性分析。2.檢測(cè)hTrm61p及NF-кB mRNA在膀胱癌5637細(xì)胞及正常人尿路上皮sc-huv-1細(xì)胞中的表達(dá):將購(gòu)自于中科院細(xì)胞庫(kù)的膀胱癌5637系細(xì)胞及正常人尿路上皮SV-HUV-1細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng),取生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞提取RNA,采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)hTrm61p及NF-кB m RNA的表達(dá)水平。3.體外觀察NF-кB抑制劑PDTC對(duì)膀胱癌5637系細(xì)胞增殖能力的影響:實(shí)驗(yàn)分4組,空白對(duì)照組(不加PDTC處理),低濃度PDTC培養(yǎng)基組(25μmol/L),中濃度PDTC培養(yǎng)基組(50μmol/L),高濃度PDTC培養(yǎng)基組(100μmol/L),培養(yǎng)24h、48h、72h,用CCK-8法檢測(cè)不同濃度PDTC處理組的5637細(xì)胞增殖情況。4.檢測(cè)NF-кB抑制劑對(duì)膀胱癌5637系細(xì)胞hTrm61p mRNA及hTrm61p蛋白表達(dá)的影響:分別應(yīng)用RT-qPCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)空白對(duì)照組及不同濃度PDTC作用后的5637細(xì)胞中hTrm61p mRNA及hTrm61p蛋白的表達(dá)。5.觀察hTrm61p及NF-кB蛋白在5637細(xì)胞中的定位情況:應(yīng)用雙重免疫熒光方法觀察hTrm61p及NF-кB蛋白在膀胱癌細(xì)胞5637中的定位。6.采用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)hTrm61p及NF-кB蛋白在膀胱癌5637細(xì)胞中的相互作用:使用抗hTrm61p單克隆抗體和抗NF-кB單克隆抗體分別沉淀5637細(xì)胞裂解液,以全蛋白組作為對(duì)照組,檢測(cè)5637細(xì)胞中hTrm61p和NF-кB蛋白的結(jié)合情況。結(jié)果:1.膀胱癌組織和癌旁組織中hTrm61p mRNA與NF-кB m RNA表達(dá)水平的檢測(cè):與癌旁組織相比,hTrm61p mRNA(2.218±0.630)和NF-кB mRNA(2.291±0.729)在癌組織中相對(duì)表達(dá)水平均明顯升高,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)癌組織中hTrm61p mRNA及NF-кB mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,結(jié)果顯示:r=0.834,提示在膀胱癌組織中,hTrm61p mRNA及NF-кB mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)。2.正常尿路上皮SV-HUV-1細(xì)胞和膀胱癌5637細(xì)胞中hTrm61p mRNA與NF-кB mRNA表達(dá)水平的檢測(cè):與正常尿路上皮SV-HUV-1細(xì)胞相比,膀胱癌5637細(xì)胞中hTrm61p mRNA(1.955±0.153)和NF-кB mRNA(2.802±0.048)表達(dá)水平明顯升高,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。3.NF-кB特異性抑制劑PDTC對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞增殖活性的影響:加入不同濃度PDTC培養(yǎng)24h后,CCK-8法檢測(cè)空白對(duì)照組及低、中、高濃度PDTC組OD值分別為0.716±0.036、0.586±0.042、0.475±0.029、0.396±0.033,與對(duì)照組相比,PDTC組OD值降低,呈濃度依賴(lài)性,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);培養(yǎng)48h后,空白對(duì)照組、低、中、高濃度PDTC組OD值分別為0.988±0.065、0.701±0.039、0.570±0.035、0.449±0.025,與對(duì)照組相比,PDTC組OD值降低,呈濃度依賴(lài)性,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);培養(yǎng)72h后,空白對(duì)照組與低、中、高濃度PDTC組OD值分別為1.127±0.052、0.827±0.012、0.647±0.029、0.499±0.036,與對(duì)照組相比,PDTC組OD值降低,呈濃度依賴(lài)性,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。說(shuō)明PDTC可降低膀胱癌5637細(xì)胞增殖能力,且呈PDTC濃度依賴(lài)性。4.NF-кB抑制劑對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞hTrm61p表達(dá)的影響:與未加PDTC的空白對(duì)照組相比,25μmol/L PDTC濃度組hTrm61p mRNA的相對(duì)表達(dá)水平為0.555±0.044,50μmol/L PDTC濃度組hTrm61p m RNA的相對(duì)表達(dá)水平為0.457±0.011,100μmol/L濃度組hTrm61p m RNA的相對(duì)表達(dá)水平為0.352±0.034,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與未加PDTC的空白對(duì)照組相比,25μmol/L PDTC濃度組hTrm61p蛋白相對(duì)表達(dá)水平為0.814±0.022,50μmol/L PDTC濃度組hTrm61p相對(duì)表達(dá)水平為0.641±0.055,100μmol/L PDTC濃度組hTrm61p相對(duì)表達(dá)水平為0.469±0.036,隨著PDTC濃度的增加,hTrm61p蛋白表達(dá)水平逐漸降低,呈濃度依賴(lài)性,各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.hTrm61p及NF-кB蛋白在膀胱癌5637細(xì)胞中的定位情況:hTrm61p蛋白定位于5637胞漿和胞核中,主要定位于胞漿中,NF-кB蛋白亦定位于5637胞漿和胞核中,主要定位于胞漿中;二者共定位信號(hào)存在于胞漿和胞核中均存在,主要存在于胞漿中。6.hTrm61p及NF-кB蛋白在膀胱癌5637細(xì)胞中的免疫共沉淀結(jié)果:全蛋白提取組中,同時(shí)存在NF-кB p65、hTrm61p蛋白的表達(dá);anti-NF-кB p65進(jìn)行CO-IP后的上清液中,僅檢測(cè)到hTrm61p蛋白表達(dá),未檢測(cè)到NF-кB p65;antiNF-кB p65進(jìn)行CO-IP后的沉淀復(fù)合物中,同時(shí)檢測(cè)到NF-кB p65及hTrm61p的表達(dá);anti-hTrm61p進(jìn)行CO-IP后的上清液中,僅檢測(cè)到NF-кB p65表達(dá),未檢測(cè)到hTrm61p;anti-hTrm61p進(jìn)行CO-IP后的沉淀復(fù)合物中,同時(shí)檢測(cè)到NF-кB p65及hTrm61p的表達(dá)。結(jié)論:1.hTrm61p mRNA與NF-кB mRNA在膀胱癌患者癌組織及細(xì)胞中均明顯高表達(dá),二者表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系,表明hTrm61p在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用與NF-кB關(guān)系密切。2.NF-кB對(duì)膀胱癌細(xì)胞中hTrm61p的表達(dá)有著重要的調(diào)控作用,抑制NF-кB活性可抑制hTrm61p的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。3.NF-кB與hTrm61p在膀胱癌5637細(xì)胞中存在相互作用,為進(jìn)一步探索膀胱癌的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)提供了新的思路。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R737.14
【圖文】：

結(jié) 果和癌旁組織中 hTrm61p 和 NF-кBmRNA 表61p 的 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平膀胱癌和癌旁組織中 hTrm61p 的 mRNA 表達(dá)情況織相比，膀胱癌組織中 hTrm61p mRNA 相對(duì)表達(dá)），且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。表明在 mRNA 水平表達(dá)水平較癌旁組織中升高。該研究結(jié)果與本課題

2：膀胱癌組織和癌旁組織中NF-кBmRNA表達(dá)水平Note:n=34,**P<0.01vsadjacenttissuegroup

圖 3.1.2：膀胱癌組織和癌旁組織中 NF-кB mRNA 表達(dá)水平Note: n=34,**P<0.01 vs adjacent tissue group胱癌組織中 hTrm61p 和 NF-кB mRNA 表達(dá)水平的相關(guān)性 3.1.3 所示，計(jì)算 34 例膀胱癌組織中 NF-кB 和 hTrm61p 的 mR進(jìn)行的相關(guān)性分析，相結(jié)果示關(guān)系數(shù) r =0.834，表明在 mRNA織中 NF-кB 與 hTrm61p 的 mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2758216