【摘要】：慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD),定義為各種原因引起的慢性腎臟結(jié)構(gòu)和功能障礙(腎臟損害病史大于3個月),包括腎臟GFR正常和不正常的病理損傷、血液或尿液成分異常,及影像學(xué)檢查異常,或不明原因GFR下降(60ml/min·1.73m~2)超過3個月�，F(xiàn)如今,CKD正日益成為一個重要的公共衛(wèi)生問題,我國CKD的患病率約為10.8%~([1])。腎臟纖維化是CKD的共同病理特征,主要表現(xiàn)在細(xì)胞外基質(zhì)的大量堆積和腎小管萎縮,是導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)的共同過程~([2])�？估w維化藥物可減緩甚至阻止CKD的進(jìn)展。近來新的證據(jù)表明,針對腎臟纖維化相關(guān)基因的miRNAs可能是CKD抗纖維化治療的潛在新靶點。MicroRNAs(miRNAs)是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA,主要通過與靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’-UTR)結(jié)合,阻止mRNA轉(zhuǎn)錄本被翻譯成蛋白質(zhì)來控制基因表達(dá),作為器官發(fā)生、癌癥和疾病的關(guān)鍵調(diào)控因子越來越受到人們的關(guān)注~([3])。研究表明,microRNAs在各種腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。而腎臟纖維化是各種慢性腎臟病進(jìn)展至終末期的共同途徑。近年研究表明,在腎臟組織中存在的一些miRNAs對腎臟纖維化的發(fā)生與發(fā)展有著重要的作用,深入地了解它們之間的關(guān)系可以為臨床腎臟纖維化的治療提供新的治療靶點。實驗一:篩選并驗證FSGS、DN、MCD患者腎組織與正常腎組織之間差異表達(dá)的microRNAs目的:篩選符合條件的FSGS、DN、MCD患者,篩選并驗證FSGS、DN、MCD患者腎組織與正常腎組織中差異表達(dá)的microRNAs。方法:利用高通量microRNAs芯片技術(shù)篩選FSGS、DN、MCD患者腎組織與正常腎組織對比差異表達(dá)的microRNAs,并采用Real-time PCR、原位雜交方法驗證部分差異microRNAs的表達(dá)和定位。結(jié)果:(1)根據(jù)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科腎穿病理結(jié)果,篩選符合條件的FSGS、DN、MCD患者腎組織,高通量microRNAs芯片結(jié)果提示與正常腎組織相比,FSGS、DN、MCD患者腎組織中689個差異表達(dá)的microRNAs(FC-CUT=1.5;P-value=0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)),上調(diào)表達(dá)的有262個microRNAs,下調(diào)表達(dá)的有427個microRNAs,其中microRNA-1470是上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最明顯的microRNA,而microRNA-4483是下調(diào)表達(dá)最顯著的microRNA。(2)原位雜交結(jié)果示miR-1470、miR-4483位于人腎小管上皮細(xì)胞的胞漿中。(3)與同周齡db/m小鼠相比,從8w開始db/db糖尿病小鼠體重及血糖水平明顯升高,16w db/db小鼠的血肌酐水平與24h尿蛋白定量均明顯增高,HE、Masson、PASM、PAS染色示16w、24w db/db小鼠糖尿病小鼠,腎小球肥大,體積增大,腎小球系膜基質(zhì)明顯擴(kuò)增,且腎小球和腎間質(zhì)膠原沉積更明顯,以上結(jié)果表明db/db糖尿病小鼠于16w時已經(jīng)出現(xiàn)糖尿病腎病的表現(xiàn),且與24w時糖尿病腎病表現(xiàn)更明顯。與control小鼠相比,FSGS小鼠于8w后血肌酐水平與24h尿蛋白定量均較control小鼠明顯增高,HE、Masson、PASM、PAS染色示腎小球硬化,腎間質(zhì)膠原沉積明顯等表現(xiàn)。(4)與db/m及control小鼠腎組織相比,miR-1470在db/db糖尿病小鼠、FSGS腎組織中明顯增高;miR-4483在db/db糖尿病小鼠、FSGS腎臟組織中表達(dá)明顯降低。同樣在DN、FSGS患者腎組織中,QPCR可見miR-1470上調(diào),而miR-4483明顯下調(diào)。在體外HK-2細(xì)胞中,與TGF-β1(-)及正常糖濃度培養(yǎng)(12.5mmol/L)相比,miR-1470在TGF-β1(+)(10ng/ml)及高糖刺激(30mmol/L)的HK-2細(xì)胞中表達(dá)明顯增高,而miR-4483的表達(dá)明顯下調(diào)。小結(jié):高通量microRNAs芯片檢測結(jié)果示與正常腎臟比較,FSGS、DN、MCD患者腎組織有689個差異表達(dá)的microRNAs,其中miR-1470上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最明顯的microRNA,而miR-4483是下調(diào)表達(dá)最顯著的microRNA。原位雜交示miR-1470、miR-4483位于人腎小管上皮細(xì)胞的胞漿中。miR-1470、miR-4483在DN、FSGS患者、小鼠模型的腎臟組織及TGF-β1、高糖刺激的人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)中的表達(dá)與芯片一致。實驗二:miR-1470、miR-4483在DN、FSGS腎組織纖維化中的作用目的:探討mi R-1470、mi R-4483在DN、FSGS腎組織纖維化中的作用。方法:通過在人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)中干擾及過表達(dá)mi R-1470、mi R-4483,采用QRT-PCR檢測HK-2細(xì)胞中a-SMA、collagen I、collagen III、Fibronectinm RNA表達(dá)變化,Western blot、Immunofluorescence方法檢測細(xì)胞中纖維化蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果:(1)與轉(zhuǎn)染mimic negative control的HK-2細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染了mi R-1470、mi R-4483 mimic過表達(dá)質(zhì)粒的HK-2細(xì)胞中mi R-1470、mi R-4483表達(dá)上調(diào),體外過表達(dá)mi R-1470可使HK-2細(xì)胞a-SMA、Collagen I、collagen III、Fibronectin m RNA表達(dá)明顯增高,Fibronectin、a-SMA、Collagen I、collagen III、Collagen IV、vimentin纖維蛋白表達(dá)增高;而體外過表達(dá)mi R-4483可使HK-2細(xì)胞a-SMA、Collagen I、collagen III、Fibronectin m RNA表達(dá)明顯降低,Fibronectin、a-SMA、Collagen I、collagen III、Collagen IV、vimentin纖維蛋白表達(dá)減少。(2)與轉(zhuǎn)染inhibitor negative control的HK-2細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染了mi R-1470、mi R-4483 inhibitor干擾質(zhì)粒的HK-2細(xì)胞中mi R-1470、mi R-4483表達(dá)下調(diào),體外抑制mi R-1470可使HK-2細(xì)胞a-SMA、Collagen I、collagen III、Fibronectin m RNA表達(dá)明顯降低,Fibronectin、a-SMA、Collagen I、collagen III、Collagen IV、vimentin纖維蛋白表達(dá)減輕;而體外抑制mi R-4483可使HK-2細(xì)胞a-SMA、Collagen I、collagen III、Fibronectin m RNA表達(dá)明顯增強(qiáng),Fibronectin、a-SMA、Collagen I、collagen III、Collagen IV、vimentin纖維蛋白表達(dá)增高。小結(jié):在TGF-β1、HG刺激下的HK-2細(xì)胞中,mi R-1470促進(jìn)HK-2細(xì)胞纖維化蛋白的合成,是損害性因子,而mi R-4483抑制其纖維化蛋白的合成,是保護(hù)性因子。實驗三:mi R-1470、mi R-4483在腎臟纖維化中作用的機(jī)制研究目的:研究mi R-1470、mi R-4483在體外HG、TGF-β1刺激下影響腎臟纖維化的相關(guān)作用機(jī)制。方法:采用生物信息學(xué)方法預(yù)測與mi R-1470、mi R-4483結(jié)合的與腎臟纖維化相關(guān)的下游靶基因,采用QRT-PCR方法檢測在HEK293T細(xì)胞中干擾或過表達(dá)mi R-1470、mi R-4483后相應(yīng)靶基因的表達(dá)情況,采用雙熒光素酶報告基因方法驗證mi R-1470、mi R-4483與其下游靶基因是否結(jié)合,并通過突變結(jié)合部位建立突變型質(zhì)粒,從而確定mi RNA與下游靶基因的結(jié)合位點。結(jié)果:(1)生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測,符合篩選條件的下游靶基因:mi R-1470有42個與腎臟纖維化相關(guān)的下游靶基因,而mi R-4483有26個與腎臟纖維化相關(guān)的下游靶基因。(2)通過QPCR驗證,在293T細(xì)胞中上調(diào)mi R-1470表達(dá)后,MMP14、MMP2、MMP13、MMP9、CTGF表達(dá)降低,而下調(diào)mi R-1470后,MMP14、MMP2、MMP13、MMP9、CTGF表達(dá)增高。而293T細(xì)胞中上調(diào)mi R-4483表達(dá)后,TIMP1表達(dá)降低,下調(diào)mi R-4483后,TIMP1表達(dá)增高。(3)雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)結(jié)果示與MMP13野生型載體共轉(zhuǎn)染時,與對照mimic control、negative control相比,轉(zhuǎn)染mi R-1470 mimic可使293T細(xì)胞的熒光素酶活性降低;與TIMP1野生型載體共轉(zhuǎn)染時,與mimic control、negative control相比,轉(zhuǎn)染mi R-4483 mimic可使293T細(xì)胞的熒光素酶活性降低。而mi R-1470 mimic與MMP13突變型質(zhì)粒、mi R-4483 mimic與TIMP1突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時,對293T細(xì)胞熒光素酶活性的恢復(fù)作用不太明顯,下一步繼續(xù)構(gòu)建突變型質(zhì)粒進(jìn)行雙熒光素酶分析。小結(jié):通過生物信息學(xué)預(yù)測,QPCR與雙熒光素酶基因報告驗證MMP13可能是mi R-1470的下游靶基因,TIMP1可能是Mi RNA-4483的下游靶基因之一。結(jié)論:1.本研究通過高通量micro RNAs芯片檢測結(jié)果示與正常腎臟比較,FSGS、DN、MCD患者腎組織有689個差異表達(dá)的micro RNAs,其中mi R-1470上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最明顯的micro RNA,而mi R-4483是下調(diào)表達(dá)最顯著的micro RNA。原位雜交示mi R-1470、mi R-4483位于人腎小管上皮細(xì)胞的胞漿中。mi R-1470、mi R-4483在DN、FSGS患者、小鼠模型的腎臟組織及TGF-β1、高糖刺激的人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)中的表達(dá)與芯片一致。2.在TGF-β1、HG刺激下的HK-2細(xì)胞中,mi R-1470促進(jìn)HK-2細(xì)胞纖維化蛋白的合成,是損害性因子,而mi R-4483抑制其纖維化蛋白的合成,是保護(hù)性因子。3.mi R-1470可能與下游靶基因MMP13結(jié)合,從而抑制其表達(dá),促進(jìn)腎臟纖維化進(jìn)程;而mi R-4483可能與下游靶基因TIMP1結(jié)合,抑制TIMP1表達(dá),從而抑制腎臟纖維化進(jìn)程。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R692
【圖文】：

男 49 878361 14174 2011-3-31男 56 883511 14286 2011-5-12表 4 各組中差異表達(dá)的 miRNAsMCD FSGS DNup 80 71 111down 122 150 155Only FSGS&DNcommom-up14Only FSGS&DNcommom-down21all-up 40all-down 76:1.5 ; P-value-CUT:0.05）

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 MicroRNA-1470、MicroRNA-4483 在慢性腎臟纖維化中的作用及機(jī)制研究1.3.2 microRNAs 表達(dá)譜芯片結(jié)果以（FSGS/control,DN/control，MCD/control）>=1.5，P-value=<0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出 682 個差異表達(dá)的 microiRNAs（圖 1-2）。A BC

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