【摘要】：研究目的:常染色體顯性多囊腎病(Autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是一個(gè)系統(tǒng)性疾病,發(fā)病率在1/1000~1/400,是最常見的遺傳性腎臟病,主要由PKD1或者PKD2基因突變導(dǎo)致。以雙側(cè)多發(fā)性腎囊腫以及進(jìn)行性腎臟總體積增大為特征,導(dǎo)致尿液濃縮障礙、高血壓、多尿、夜尿癥、疼痛、腎結(jié)石、血尿,感染和腎功能逐漸喪失。在歐洲,每10名終末期腎病(End stage renal disease,ESRD)患者中就有1名是ADPKD,在美國(guó)、澳大利亞和新西蘭每20例終末期腎病患者中有1例有ADPKD。長(zhǎng)期以來(lái),多囊腎病的治療和管理并不像其他腎臟病發(fā)展的那么迅速,因此尋找有效治療ADPKD的方法顯得尤為重要。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome system,UPS)是重要的蛋白質(zhì)水解系統(tǒng),負(fù)責(zé)降解許多參與細(xì)胞生命活動(dòng)的蛋白質(zhì),包括細(xì)胞周期進(jìn)展、凋亡、DNA損傷/修復(fù)、內(nèi)吞作用、耐藥性、血管生成和細(xì)胞分化,對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡至關(guān)重要,在腫瘤發(fā)生和腫瘤存活中發(fā)揮著重要作用。β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素重復(fù)序列包含蛋白(β-transducin repeats-containing proteins,β-TrCP)是SCF家族的一員,在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中作用顯著。目前很少有關(guān)于UPS在常染色體顯性多囊腎病中的研究,因此本文主要探討E3泛素連酶β-TrCP在ADPKD中的作用以及調(diào)控機(jī)制。并以UPS為靶點(diǎn),抑制UPS或者特異性抑制β-TrCP觀察其對(duì)囊腫生長(zhǎng)的作用,為臨床診療ADPKD提供新思路。研究方法:首先我們想了解β-TrCP在多囊腎病中的表達(dá)情況,因此我們通過(guò)蛋白免疫印跡(Western blot)、免疫組化、免疫熒光等多種方法檢測(cè)了多囊腎病患者腎組織、PKD小鼠模型腎組織以及人永生化的囊腫襯里上皮細(xì)胞(Pkd1~(+/-)細(xì)胞)中的β-TrCP,發(fā)現(xiàn)其表達(dá)上調(diào)。其次,我們想要了解β-TrCP在多囊腎病中表達(dá)上調(diào)的機(jī)制。我們?cè)谀夷[襯里上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)以及抑制STAT1檢測(cè)β-TrCP的表達(dá)以及啟動(dòng)子活性,隨之我們過(guò)表達(dá)PC1 C末端剪切片段(Polycystin1 C terminal tail,PC1-CTT)檢測(cè)β-TrCP的表達(dá)以及啟動(dòng)子活性,驗(yàn)證PC1-CTT是否可以通過(guò)激活JAK2-STAT1通路上調(diào)β-TrCP的表達(dá)。緊接著我們想要了解β-TrCP過(guò)表達(dá)在多囊腎病發(fā)展中的作用。我們通過(guò)給予MDCK細(xì)胞UPS抑制劑PS-341處理以及在IMCD3細(xì)胞中特異性敲低β-TrCP,發(fā)現(xiàn)囊泡生長(zhǎng)受到抑制,證實(shí)了β-TrCP在多囊腎病中作為癌蛋白的身份。接下來(lái),我們檢測(cè)了PS-341處理以及特異性敲低β-TrCP后細(xì)胞的增殖和凋亡情況、纖毛的形態(tài)和纖毛上多囊蛋白2(Polycustin 2,PC2)的表達(dá),以及β-TrCP的底物PDCD4以及PC2總量變化,并進(jìn)一步探討了自噬降解途徑與泛素-蛋白酶體途徑的交叉和相互作用。由于目前還沒有特異性的β-TrCP抑制劑,因此我們暫且選擇蛋白酶體抑制劑PS-341作為治療性藥物,在早發(fā)型PKD小鼠模型中探討其對(duì)多囊腎病的治療作用。給予PKD小鼠模型PS-341 0.3mg/kg腹腔注射,每周兩次。收集標(biāo)本檢測(cè)腎功能和囊腫指數(shù)以及生存曲線。結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)E3泛素蛋白連接酶β-TrCP在常染色體顯性多囊腎病患者、PKD小鼠模型以及囊腫襯里上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),且主要定位細(xì)胞核中。接著我們研究了β-TrCP在囊腫襯里上皮細(xì)胞中高表達(dá)的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)囊腫形成后,PC1-CTT剪切增多,PC1-CTT通過(guò)活化下游JAK2-STAT1信號(hào)通路促進(jìn)β-TrCP表達(dá)。接下來(lái)我們研究β-TrCP的作用,我們發(fā)現(xiàn)PS-341可以通過(guò)增加纖毛長(zhǎng)度以及纖毛上PC2的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖,最終抑制三維立體培養(yǎng)環(huán)境下MDCK細(xì)胞形成囊泡,但對(duì)β-TrCP的底物PDCD4和PC2的總量沒有影響。特異性下調(diào)β-TrCP可以抑制IMCD3細(xì)胞形成囊泡,在人的囊腫襯里上皮細(xì)胞中特異性敲低β-TrCP后,纖毛變長(zhǎng),纖毛上PC2表達(dá)增加,PDCD4表達(dá)上調(diào),PC2總量變化不明顯,說(shuō)明下調(diào)β-TrCP可以通過(guò)上調(diào)其底物PDCD4以及促進(jìn)纖毛的形成和PC2在纖毛上的定位抑制囊泡生長(zhǎng)。而過(guò)表達(dá)BTRC基因后,纖毛變短,甚至不能正常形成。但是,PS-341處理細(xì)胞后,PDCD4和PC2的泛素化降解受到抑制,為什么其總蛋白量卻沒有改變呢?這使得我們繼續(xù)探討其原因,我們發(fā)現(xiàn),PS-341處理囊腫細(xì)胞后,自噬通路代償性活化。PDCD4和PC2可能通過(guò)自噬通路代償性降解。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),PS-341治療后,小鼠腎臟的囊腫指數(shù)顯著降低,腎功能明顯改善,生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)。我們進(jìn)一步檢測(cè)了腎組織中增殖、凋亡和炎癥指標(biāo),發(fā)現(xiàn)PS-341治療后小鼠腎組織增殖減弱,凋亡增加,炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。結(jié)論:(1)在常染色體顯性多囊腎病中,PC1-CTT通過(guò)活化JAK2-STAT1通路促進(jìn)β-TrCP的表達(dá);(2)β-TrCP作為癌蛋白在ADPKD中高表達(dá);(3)特異性抑制β-TrCP可以通過(guò)上調(diào)PDCD4、增加纖毛長(zhǎng)度以及PC2在纖毛上的有效劑量抑制囊泡生長(zhǎng);(4)PS-341促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖,最終抑制囊泡生長(zhǎng),可能是通過(guò)使纖毛變長(zhǎng),增加纖毛上的PC2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。(5)PS-341可以通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及減少腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),顯著地抑制囊腫生長(zhǎng)、改善腎功能,并且顯著延長(zhǎng)多囊腎病小鼠的生存時(shí)間。(6)廣譜抑制UPS治療ADPKD引起自噬通路代償性活化,可能會(huì)伴隨某些副作用。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R692
【圖文】：

TrCP 在常染色體顯性多囊腎病中的調(diào)控機(jī)制及治療意義- 9 -圖1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)示意圖[36]E3泛素連接酶β-TrCP是SCF家族的一員，鑒于其底物的多樣性，β-TrCP可能同時(shí)發(fā)揮致癌作用和抑癌活性。但可以確定的是，在特定的組織里，一些抑癌因子作為其底物，例如IκB（NF-κB 的負(fù)性調(diào)控因子）[37]， PDCD4（Eif4A介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)錄的負(fù)性調(diào)控因子）[38]，以及BimEL（一個(gè)強(qiáng)效的促凋亡蛋白）[39]，因此β-TrCP是致癌基因。以蛋白酶體作為抗腫瘤治療的靶點(diǎn)，20S蛋白酶體抑制劑硼替佐米（BTZ,Bortizomib）已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于治療多發(fā)性骨髓瘤以及其他的一些血液系統(tǒng)腫瘤

E3 泛素蛋白連接酶 β-TrCP 在常染色體顯性多囊腎病中的調(diào)控機(jī)制及治療意義實(shí)驗(yàn)結(jié)果（一） -TrCP 在多囊腎病患者腎組織中的表達(dá)我們?nèi)∈中g(shù)切除的晚期 ADPKD 患者的腎組織為多囊腎病標(biāo)本，腎癌患者手術(shù)除距癌組織 5 厘米以上的腎組織為正常對(duì)照標(biāo)本，使用蛋白免疫印跡法（Westernlotting）檢測(cè) β-TrCP 的表達(dá)水平，并進(jìn)行灰度分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組（1.0000.08948 ）相比， -TrCP 在 ADPKD 患者（3.154 ±0.2932 ）腎組織中表達(dá)明顯升，P=0.0022，見圖 1-1-1、圖 1-1-2。

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本文編號(hào)：2719066