發(fā)布時間：2020-05-10 11:26

【摘要】：尿毒癥是泌尿內(nèi)外科治療中難題之一。全球有超過4億糖尿病患者,而糖尿病腎病作為糖尿病的嚴重并發(fā)癥,約有40%的糖尿病患者繼發(fā)糖尿病腎病,糖尿病腎病也是引起尿毒癥等終末期腎病主要原因之一。雖然,器官移植被認為是比較理想的治療措施,但我國目前尚存在巨大的供體器官缺口,大量終末期腎病患者難以得到及時的器官移植治療。因此,有效地治療糖尿病腎病,并延緩其進展為終末期腎疾病具有重大意義。免疫調(diào)節(jié)對于腎移植等具有重要意義,我科已經(jīng)開展了一系列的研究,但免疫系統(tǒng)極其復雜,利用單一藥物很難調(diào)控。中藥具有作用溫和、多靶點作用等特點,一直被期待成為改善免疫,保護細胞的藥物之一。雞樅菌(Termitornyces albuminosus(Berk)Heim),是我國名貴的藥食兩用大型真菌,具有增強機體免疫力,抗氧化,解酒保肝,抗腫瘤以及鎮(zhèn)痛抗炎等多種藥理活性。提示我們通過對雞樅菌的深入研究,可能為防治糖尿病腎病,進而減少或延緩尿毒癥等的發(fā)生提供新的可能。氧化應激在機體免疫力低下及糖尿病的病程中均發(fā)揮重要作用。Nrf2信號傳導被認為是身體抵抗內(nèi)部環(huán)境的氧化和化學刺激的重要防御轉導途徑,其調(diào)節(jié)HO-1和Keap1的表達水平。另外,NF-κB是一種普遍存在的轉錄因子,是炎癥反應的主要調(diào)節(jié)因子,并易被許多特異性刺激物激活。此外,越來越多的證據(jù)表明,NF-κB是參與DN中許多相關途徑變化的核心,例如腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活,AGE積累和NADPH依賴性氧化應激。但是腎病的發(fā)病機制極其復雜,包括免疫失調(diào)等多因素、多途徑機制,需要進一步研究與探討。因此,我們制備了雞樅菌水提物,利用糖尿病db/db小鼠,在體內(nèi)研究雞樅菌可能通過抗氧化應激等的作用,將會有助于早期控制糖尿病等引起的腎損傷,避免發(fā)展成為尿毒癥,延緩或避免腎移植。提出治療糖尿病腎病等的藥物機制,減少尿毒癥的發(fā)生。方法:(1)采用化學計量學方法建立PT的有效成分含量的檢測方法以及綜合多糖、總黃酮和甘露醇含量建立期望函數(shù),通過響應面方法進行分析,對PT的提取條件進行優(yōu)化;并通過HPLC、UV、GC-MS等多種分析方法對雞樅菌的主要成分進行檢測。(2)運用CTX腹腔注射于Balb/c小鼠體內(nèi),誘導建立免疫抑制小鼠模型,然后經(jīng)過14天的PT的灌胃給藥治療后,期間監(jiān)測小鼠體重和臟器指數(shù)的變化并檢測免疫抑制小鼠淋巴細胞的增殖以及NK細胞活性的改變;通過ELISA檢測氧化應激因子、炎癥因子以及免疫球蛋白;通過Western Blotting實驗檢測免疫抑制小鼠中Nrf2、HO-1、SOD1、Keap-1和CAT等氧化應激相關蛋白的表達。(3)采用db/db小鼠進行糖尿病小鼠實驗。將PT對db/db小鼠進行灌胃給藥治療持續(xù)8周,在這期間每隔一周進行稱重及測血糖;通過病理切片觀察PT給藥后,db/db小鼠的胰島形態(tài),胰島細胞數(shù)量,腎小球系膜基膜厚度,腎小管空泡的數(shù)量,肝細胞變性情況;通過ELISA檢測小鼠的糖代謝相關因子、脂代謝相關因子、DN相關因子以及氧化應激相關因子的表達;通過抗體芯片篩選小鼠腎臟主要炎性因子,并通過ELISA試劑盒檢測篩選出的炎性因子水平變化;通過Western Blotting實驗,檢測db/db小鼠腎臟組織中JAK2、STAT3、IKKα+β、IKBα、NF-κB和AKT1/2/3蛋白活性表達水平。結果:(1)優(yōu)化的結果提示在三因子三水平條件下,提取溫度為88.9℃、提取時間為3.63h,提取料液比為1:25.8和提取次數(shù)為2次的條件時PT期望值最高。通過HPLC、UV、GC-MS等多種分析方法對雞樅菌的主要成分進行檢測后,結果可以發(fā)現(xiàn)雞樅菌中含量最多的是蛋白質(zhì),約占39.7%,其次是可溶性的總糖,約占30.0%,第三是還原糖,約占雞樅菌含量的10.0%。除此之外,雞樅菌中還有0.029%的總黃酮,0.2%的粗脂肪,0.023%的總三萜以及2.569%的甘露醇等成分。(2)CTX腹腔注射誘導建立免疫抑制小鼠模型,并經(jīng)過14天的PT的灌胃給藥治療后,其結果發(fā)現(xiàn)相比于免疫抑制小鼠,PT能夠明顯改善免疫抑制小鼠體重和臟器指數(shù)的變化,促進免疫抑制小鼠淋巴細胞的增殖以及NK細胞活性的增強;ELISA檢測結果表明PT能夠顯著增加免疫抑制小鼠血清和脾臟中的SOD、CAT、GSH-PX、IL-2、IL-6、IL-10、IFN-α、IFN-γ、IgA、IgG的表達水平,而對MDA、ROS的含量表達具有明顯的抑制作用;Western Blotting實驗的結果表明PT能夠顯著促進免疫抑制小鼠脾臟中Nrf2、HO-1、SOD1和CAT的蛋白表達,而對Keap-1的蛋白表達水平具有明顯的抑制作用。(3)結果發(fā)現(xiàn)PT能夠有效的抑制db/db小鼠體重過度增長和血糖含量的增高,降低小鼠的攝食量和攝水量,并且能夠抑制小鼠的胰島素抵抗狀態(tài),改善胰島素的敏感性,進而改善血糖代謝功能;通過病理切片實驗可以看到經(jīng)過PT給藥后,db/db小鼠的胰島形態(tài)恢復至接近圓形,胰島細胞數(shù)量減少,腎小球系膜基膜厚度降低,腎小管空泡減少,肝細胞變性緩解;ELISA檢測的結果表明PT對小鼠血清中INS、ATP、HDL-C和ALB以及腎臟中PK、MMP-9、6-K-PGF1α、CAT、SOD和GSH-Px的含量表達水平具有促進作用,而明顯抑制了血清中GhbAlc、LDL-C和BUN,尿液中NAG以及腎臟中PKA和ROS的含量表達;抗體芯片篩選的結果提示,PT能夠促進糖尿病小鼠32種炎性因子的含量顯著升高,對5種炎性因子的含量明顯下降;ELISA試劑盒的檢測結果提示PT顯著降低了db/db小鼠腎臟中TNF-α、IL-2、NF-κB、TSG-14、CHI3L1、IL-12和IFN-γ的表達水平,而增加了IL-4的表達水平,與抗體芯片的結果相一致,證明PT能夠調(diào)節(jié)腎臟中炎性因子的水平,發(fā)揮抑制炎癥的作用,改善DN。Western Blotting的結果發(fā)現(xiàn)PT可以降低db/db小鼠腎臟組織中JAK2、STAT3、IKKα+β、IKBα、NF-κB和AKT1/2/3蛋白活性表達水平。結論:1.PT可以增強免疫細胞的功能,促進免疫相關因子的表達,調(diào)節(jié)免疫功能,發(fā)揮保護作用。2.通過小鼠體重的改變,血糖的變化,攝食攝水行為的改變,大體標本的改變,血BUN、蛋白尿及腎相關炎癥因子的變化,證明可以減輕腎損傷。3.通過INS、ATP、HDL-C、LDL-C和ALB以及腎臟中PK、MMP-9、6-K-PGF1α等的變化,提示雞樅菌水提物可能通過多種途徑發(fā)揮保護作用。4.通過SOD、CAT、GSH-Px、JAK2、STAT3、IKKα+β、IKBα、NF-κB和AKT1/2/3等的變化,可以反映出,可能是通過JAK/STAT3途徑與NF-κB途徑,發(fā)揮抗氧化應激、調(diào)節(jié)血糖、血脂水平以及抗炎的作用進而來達到輔助治療二型糖尿病及DN的作用。因此,本實驗通過體內(nèi)外實驗,初步闡明了雞蘑所含活性成分通過多種途徑減輕細胞損傷的機制,同時,也為探索糖尿病等引起的腎損傷提供了理論與實驗依據(jù)。
【圖文】：

溴甲酚綠，石油醚，海砂，乙酸鋅和亞鐵氰化鉀等均為方法有效成分含量檢測方法 中總糖含量的測定萄糖標準曲線的繪制取葡萄糖標準溶液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 m瓶中用水定容至刻度，搖勻。準確吸取上述葡萄糖標準溶液于 1 mL 苯酚溶液充分混合，迅速加入 5 mL 濃硫酸充分混合，室0 nm 的條件下，以空白溶液作為對照組，測定吸 OD 值。記錄為橫坐標，A490 為縱坐標，繪制標準曲線。

樣溶液的測定取待測液，加入比色管中，加入 1 mL 苯酚溶液充分混合，迅混合，室溫下放置 30 min，在 490 nm 波長下，以 0 管為參比，線如圖 2.1 所示，根據(jù)回歸方程計算獲得總糖含量。 中還原糖含量的測定準曲線的制作葡萄糖試劑，在烘箱中 100℃溫度下鼓風干燥，至重量不變， 1 mg/mL 即成標準溶液。取 0，0.1，0.2，0.3，0.4 和 0.5 mL 水，稀釋至 0.5 mL。搖勻后加入 1.5 mL 的 DNS 試劑，再次搖于冷水中使其充分冷卻。每管中再加入 4 mL 去離子水混勻，D 值，，經(jīng)過計算得到標準曲線。標準曲線如圖 2.2 所示。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R587.2;R692.9

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本文編號：2657227