【摘要】：研究背景:糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)患者最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一。DN的發(fā)病機(jī)制目前非常復(fù)雜,近年來(lái)有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙會(huì)促進(jìn)DN的發(fā)展。內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Endothelial-mesenchymal transition,EndMT)過(guò)程中產(chǎn)生的成纖維細(xì)胞是腎成纖維細(xì)胞的主要來(lái)源之一,后者在腎纖維化的過(guò)程中發(fā)揮著很大的作用,而腎臟纖維化是DN的主要病理表現(xiàn)。炎癥因子、高糖等能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生EndMT,從而逐步引起所有腎臟細(xì)胞纖維化,最終使腎臟失去功能。因此,EndMT在腎臟纖維化過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用,是內(nèi)皮細(xì)胞損傷-纖維化的重要原因和轉(zhuǎn)歸。EndMT在發(fā)生的時(shí)候,內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)失去特異性的標(biāo)志物。例如血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白(vascularendothelialcadherin,VE-cadherin),從而重新獲得了間充質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志,例如波形蛋白(vimentin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscleactin,α-SMA)等等。盡管目前發(fā)現(xiàn),EndMT可能是導(dǎo)致腎纖維化的重要機(jī)制,但其具體調(diào)控尚未清楚。與此同時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞損傷纖維化會(huì)涉及到眾多的分子信號(hào)通路,其中Wnt/β-catenin可以進(jìn)行調(diào)節(jié)參與纖維化進(jìn)展,此信號(hào)通路在腎臟纖維化中的角色地位已經(jīng)得到了許多研究學(xué)者的證實(shí)。并且有相關(guān)研究證明了 Wnt/β-catenin信號(hào)通路途徑和腎臟EMT發(fā)生有關(guān)系,而EndMT實(shí)際上就是EMT的一種特殊類型,所以這個(gè)角度出發(fā),探索EndMT的調(diào)控機(jī)制對(duì)防治DN是一個(gè)新的方向。中醫(yī)藥制劑腎康丸在一定程度可改善DN,延緩DN進(jìn)展,但目前并無(wú)研究表明腎康丸是否能阻斷EndMT從而更好地治療DN。因而,本實(shí)驗(yàn)使用腎康丸來(lái)干預(yù)DN纖維化小鼠觀察EndMT及Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)表達(dá)情況,初步探討腎康丸對(duì)糖尿病腎病纖維化EndMT的干預(yù)療效和初步機(jī)制。研究目的:觀察腎康丸對(duì)DN小鼠腎纖維化的療效進(jìn)展,研究腎康丸對(duì)EndMT相關(guān)表達(dá)蛋白的影響及探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路在EndMT和促使腎纖維化過(guò)程中的作用,以及腎康丸是否能夠抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路,減輕EndMT,對(duì)腎纖維化起到治療作用,探索可能機(jī)制。研究方法:1、動(dòng)物分組與造模:選擇7-8周齡的C57小鼠喂養(yǎng),待小鼠完全適應(yīng)了外周環(huán)境,排除環(huán)境干擾,按隨機(jī)分組的方法,抽樣分為正常對(duì)照組、DN模型組、中藥高中低干預(yù)組、厄貝沙坦對(duì)照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每組分10只小鼠,除正常對(duì)照組外其余小鼠進(jìn)行DN造模,利用STZ建立小鼠糖尿病模型,將STZ溶解于O.1mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液(pH4.5)中。向小鼠右側(cè)腹腔中一次性注射STZ(37.5mg·kg-1),若血糖值高于16.7 mol·L-1、尿量明顯增加,則造模成功,計(jì)算成模率。造模后分別灌胃給藥治療8周。治療期間及治療后觀察小鼠一般狀況、血糖、體重。2、末次給藥后將小鼠放入代謝籠中,計(jì)24h尿量。然后將小鼠用苯巴比妥鈉按照250mg/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉,眼眶采血,分離血清,檢測(cè)小鼠24h尿白蛋白量、血肌酐、尿素氮、內(nèi)生肌酐清除率等數(shù)值情況3、HE、MASSON染色觀察組織糖尿病腎臟病理和纖維化程度,觀察每組之間的病理變化。4、使用免疫組化、蛋白質(zhì)印跡法(Westernblot,WB)檢測(cè)觀察標(biāo)記物α-sma、vimentin、VE-cadheri在組織中的蛋白表達(dá)量。5、RT-PCR、WB 檢測(cè) Wnt1、β-catenin、P-GSK-3β的 mRNA 和蛋白表達(dá),各組之間進(jìn)行比較。結(jié)果:1、50只小鼠用于造模,成模率92.0%(46/50),成模后病死率8.6%(4/46)。在治療期間的8周里,模型組小鼠血糖均維持在16.7mmol·L-1以上,表現(xiàn)出多飲、多食、多尿、消瘦的癥狀;與模型組相比,腎康丸組和厄貝沙坦組的血糖有不同程度的下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與正常小鼠相比,模型組24h尿蛋白定量明顯高于正常組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),腎康丸中、高劑量組24h尿蛋白定量明顯低于模型組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);模型組與正常組比較,BUN、Scr明顯升高,Ccr顯著下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);腎康丸中、高劑量組與模型組比較,BUN、Scr顯著降低,Ccr明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、HE染色提示正常組的腎臟組織表現(xiàn)正常,系膜基質(zhì)分布未見(jiàn)明顯增多。模型組小鼠腎臟組織出現(xiàn)系膜基質(zhì)增多,囊腔狹窄。厄貝沙坦組、腎康丸低、中、高劑量組處理后病理改變減輕,系膜區(qū)基質(zhì)增生減少。Masson染色顯示,模型組染色呈強(qiáng)陽(yáng)性,纖維組織片狀增生,明顯纖維化;各用藥干預(yù)組纖維組織增生少量分布,纖維化程度不同程度減弱。3、免疫組化和WB結(jié)果提示和正常組相比,模型組的α-sma、vimentin蛋白表達(dá)量會(huì)升高,VE-cadherin表達(dá)量降低。而與模型組比較,厄貝沙坦組、腎康丸低、中、高劑量組的α-sma、vimentin表達(dá)量降低、E-cadherin表達(dá)量升高。4、RT-PCR和WB結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組的腎組織Wntl、P-GSK-3β、β-catenin的mRNA和蛋白明顯增多(p0.05);而與模型組比較,腎康丸干預(yù)后的小鼠腎臟中的腎組織Wnt1、P-GSK-3β、β-catenin的mRNA和蛋白均低于模型組(P0.05)。厄貝沙坦組與腎康丸組之間無(wú)顯著差異(P0.05)。結(jié)論:Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化參與DN小鼠腎纖維化的發(fā)病過(guò)程,腎康丸可以改善DN模型小鼠的腎功能,抑制腎臟纖維化。其機(jī)制可能會(huì)通過(guò)下調(diào)Wnt1、β-catenin、P-GSK-3β等的表達(dá),抑制Wnt/β-catenin通路活化,從而上調(diào)VE-cadherin表達(dá),減少α-SMA、Vimentin表達(dá),從而抑制EndMT,起到抗腎纖維化的作用。腎康丸可以通過(guò)調(diào)控β-catenin來(lái)抑制EndMT的發(fā)展從而阻止和延緩腎纖維化進(jìn)展,為DN的治療提供新的研究機(jī)制。
【圖文】：

具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｐ＜0．邋０５）。同模型組相比較，中藥干預(yù)組和厄貝沙逡逑坦對(duì)照組的ａ＿ＳＭＡ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ蛋白表達(dá)相對(duì)減少，而ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白表達(dá)則逡逑增多，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜0．邋０５）。（見(jiàn)圖５、圖６）逡逑圖５：各組小鼠腎臟組織中ａ－ＳＭＡ，，邋ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，Ｖｉｍｅｎｔｉｎ的蛋白表達(dá)逡逑Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ａ－ＳＭＡ，邋ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，邋Ｖｉｍｅｎｔｉｎ邋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｉｎ邋Ｋｉｄｎｅｙ邋Ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋Ａｌｌ邋Ｇｒｏｕｐｓ逡逑ＧＡＰＤＨ逡逑ａ－ＳＭＡ逡逑ＶＥ－ｃ＾ｄｈｅｒｍｖ邐＼逡逑Ｖｉｍｅｎｔｉｎ邐屸邋，松一洲＿？？ｉ邐“}0蒙嘛V/—一逡逑紐逡逑ＮＣ邋ＭＯＤ邋Ｌ邋Ｍ邋Ｈ邋Ｅ逡逑，邋８ｉ逡逑蛋邐ｓ邐■ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑＾邐６－邐＊邐＿邐＿邋ｍｏｄｅｌ逡逑１邐ＪＪｌｌｉＬｉｌｉ邐Ｊｌ邐１１邐＆逡逑圖６各組小鼠腎臟組織中ａ－ＳＭＡ，ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，Ｖｉｍｅｎｔｉｎ的蛋白表達(dá)逡逑注：與正常組比較，卞＜０．０５；與模型組比較，

ｃａｔｅｎｉｎ、Ｐ－ＧＳＫ－３Ｐ的蛋白含量表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ＰＣ０．０５）。逡逑而與模型組對(duì)比較，腎康丸干預(yù)各組和厄貝沙坦對(duì)照組的上述蛋白含量表達(dá)均逡逑低于模型組的表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜0．邋０５）。（如圖８、圖９所示）。逡逑圖８：各組小鼠腎臟組織中ｆｆｎｔｌ、Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｐ－ＧＳＫ－３Ｐ蛋白表達(dá)情況逡逑Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｗｎｔｌ，邋Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ邋ａｎｄ邋Ｐ－ＧＳＫ－３Ｐ邋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｉｎ邋Ｋｉｄｎｅｙ邋Ｔｉｓｓｕｅ邋ｏｆ邋Ａｌｌ邋Ｇｒｏｕｐｓ逡逑Ｗｎｔｌ邐咖邐ｒｎｍｍｍ逡逑Ｂ—ｃａｔｅｎｌｎ逡逑廣．ｖＷｖＷＶＷｖＶｖ逡逑Ｐ－ＧＳＫ－３＾邐？—逡逑ｊ逡逑Ｎ邋Ｍ邋Ｌ邋Ｍ邋Ｈ邋Ｅ逡逑Ｃ邋０逡逑Ｄ逡逑８－ｉ邐．逡逑ｔ邐■■邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑？邐．邐ｌｉ：邋ｆ邐Ｍ邐Ｍｏｄｅｌ逡逑ｆ邋ｉ（邐－Ｌ逡逑１邋Ｉｊｉｉｉｉｉｉｌｉｉｒ逡逑＾邐＾逡逑圖９各組小鼠腎臟組織中Ｗｎｔｌ、Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｐ－ＧＳＫ－３Ｐ蛋白表達(dá)情況逡逑注：與正常組比較，ＢＰ＜０．０５；與模型組比較，叩＜０．０５逡逑３３逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 Jean Jacques N Noubiap;Jashira Naidoo;Andre P Kengne;;Diabetic nephropathy in Africa:A systematic review[J];World Journal of Diabetes;2015年05期

2 閆U

本文編號(hào)：2618231