發(fā)布時間：2020-03-30 17:15

【摘要】：背景和目的各種慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)常伴隨不同程度的腎臟炎癥。疾病早期,炎癥發(fā)揮保護作用,但持續(xù)的炎癥狀態(tài)最終促進腎損傷,進而造成病理上的腎臟纖維化及臨床上的終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)。在細胞水平,炎細胞的招募及活化是核心。在浸潤的多種炎癥細胞中,巨噬細胞在調(diào)節(jié)腎臟炎癥及纖維化中發(fā)揮重要作用。臨床研究提示,CKD患者中,腎臟巨噬細胞浸潤越多,預后越差。循環(huán)中的單核細胞在炎癥信號的驅(qū)使下進入腎臟,經(jīng)歷不同途徑分化為經(jīng)典激活的M1型巨噬細胞或選擇激活的M2型巨噬細胞。在持續(xù)損傷作用下,M1型巨噬細胞促進炎癥,最終導致腎臟纖維化;M2型巨噬細胞發(fā)揮抗炎作用,最終修復腎臟損傷。環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)是花生四烯酸(arachidonic acid,AA)經(jīng)細胞色素 P450(cytochrome P-450,CYP450)的代謝產(chǎn)物,在體內(nèi)發(fā)揮舒張血管、促進血管再生、抗炎、抗氧化、抗血小板聚集及利鈉等重要的生理學功能。EETs在可溶性表氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase,sEH)作用下,降解為失活的脫氫二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acids,DHETs)。因此,sEH是決定EETs生物學活性的關(guān)鍵分子�；蚯贸蛩幚韺W阻斷sEH,增加組織或血漿中EETs水平,可增加其生物學效應(yīng)。研究提示,無論利用基因手段還是藥理學干預sEH,增加EETs,均可發(fā)揮降壓及抗炎作用,能夠在糖尿病腎病、高血壓腎病及單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)腎臟纖維化動物模型中預防纖維化的進展。sEH在腎間質(zhì)炎細胞浸潤的機制及途徑尚不清楚。腎小管上皮細胞高表達sEH是否對巨噬細胞浸潤及極化發(fā)揮作用,尚未見報道。在中國,IgA腎病是CKD最常見的病理類型,除了腎小球病變外,多表現(xiàn)為不同程度的腎小管間質(zhì)炎細胞浸潤。本研究將利用IgA腎病腎穿刺組織,分析sEH表達與臨床及病理指標的相關(guān)性;通過體外細胞實驗觀察蛋白尿刺激及調(diào)控sEH表達對巨噬細胞極化的影響,探討腎小管上皮細胞sEH表達與巨噬細胞極化的關(guān)系及其機制,為sEH抑制劑治療腎臟慢性炎癥狀態(tài)及延緩纖維化進展提供干預的新靶點。研究共分兩個部分:第一部分:IgA腎病腎小管sEH表達與臨床及病理指標的相關(guān)性研究利用IgA腎病腎穿刺組織,進行sEH免疫組化染色,分析腎組織sEH表達與臨床及病理指標的相關(guān)性;探討腎小管上皮細胞sEH表達與巨噬細胞浸潤及炎癥因子分泌的相關(guān)性,為進一步探討sEH與巨噬細胞浸潤及極化作用提供臨床證據(jù)。第二部分:腎小管上皮細胞sEH參與巨噬細胞極化的機制研究觀察蛋白尿及調(diào)控sEH表達對腎小管上皮細胞分泌誘導巨噬細胞極化炎癥因子表達的影響;用不同條件干預sEH活性的腎小管上皮細胞培養(yǎng)基孵育巨噬細胞,觀察巨噬細胞極化的標志物及細胞轉(zhuǎn)導通路關(guān)鍵蛋白的變化,探討腎小管上皮細胞sEH參與巨噬細胞極化的作用及可能機制。第一部分IgA腎病腎小管sEH表達與臨床及病理指標的相關(guān)性研究一、材料與方法收集我院腎內(nèi)科經(jīng)腎穿刺診斷為IgA腎病的腎穿刺組織標本、冰凍切片、尿液及臨床病理資料共71例。冰凍切片進行sEH免疫組化染色,根據(jù)腎小管sEH染色陽性部位面積分為+～++++四組。1.收集臨床數(shù)據(jù):年齡、性別、平均動脈壓、24小時尿蛋白定量及估算的腎小球濾過率(estimating glomerular filtration rate,eGFR);2.病理學數(shù)據(jù):系膜細胞增殖、毛細血管內(nèi)細胞增生、節(jié)段性腎小球硬化、腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化、腎小管間質(zhì)炎細胞浸潤;3.腎組織標本進行Western blot檢測sEH蛋白質(zhì)水平表達;4.利用ELISA試劑盒檢測尿液14,15-EET/14,15-DHET評估腎組織sEH活性;5.冰凍切片進行sEH及CD68免疫熒光雙染色;6.腎組織標本進行Realtime-PCR檢測MCP-1、IL-6、CSF-1、TNF-αmRNA水平表達。二、結(jié)果1.IgA腎病組腎組織sEH表達及活性明顯增加。應(yīng)用免疫組化染色半定量及Western blot結(jié)果提示,與正常對照組相比,IgA腎病組腎小管sEH蛋白質(zhì)表達明顯增加(P0.05)。隨著sEH在腎小管表達的增加,14,15-EET/14,15-DHET減小,sEH活性增加(P0.05)。2.在sEH表達程度不同的IgA腎病組四組間,平均動脈壓、蛋白尿、腎間質(zhì)炎細胞浸潤差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。隨著sEH表達增加,平均動脈壓、蛋白尿及腎間質(zhì)炎細胞浸潤程度逐漸加重。3.腎小管sEH表達與平均動脈壓(r=0.408)、蛋白尿(r=0.452)、腎間質(zhì)炎細胞浸潤(r=0.247)呈正相關(guān)(均P0.05)。4.免疫熒光染色結(jié)果提示sEH陽性的腎小管周圍存在較多CD68陽性的巨噬細胞。5.Realtime-PCR結(jié)果提示sEH低表達IgA腎病組腎組織MCP-1、IL-6、CSF-1及TNF-α mRNA明顯高于正常對照組(P0.05),sEH高表達IgA腎病組上述指標明顯高于sEH低表達IgA腎病組(P0.05)。三、結(jié)論在IgA腎病腎組織中,腎小管sEH表達及活性明顯增加;腎小管sEH表達與平均動脈壓、24小時尿蛋白定量及腎間質(zhì)炎細胞浸潤有關(guān);腎小管sEH表達可能促進巨噬細胞極化細胞因子表達,參與巨噬細胞浸潤及極化。第二部分腎小管上皮細胞sEH參與巨噬細胞極化的機制研究一、材料與方法以人近端腎小管上皮細胞系(HK-2)及小鼠巨噬細胞系(RAW264.7)為研究對象。應(yīng)用蛋白尿、sEH抑制劑+蛋白尿、EET+蛋白尿及sEH過表達腺病毒處理HK-2細胞。用上述不同條件處理的HK-2細胞培養(yǎng)基,孵育RAW264.7細胞系,IFN-y及IL-4作為誘導M1型及M2型巨噬細胞的陽性對照。Western blot檢測 sEH、p65、p-p65、Akt、p-Akt 蛋白表達,Realtime-PCR 檢測 MCP-1、IL-6、CSF-1、TNF-α、iNOS、Arg-1、IL-10mRNA 表達。二、結(jié)果1.與正常對照組相比,尿蛋白組HK-2細胞sEH蛋白質(zhì)水平及MCP-1、IL-6、CSF-1、TNF-αmRNA水平表達明顯增加(均P0.05)。與蛋白尿組相比,sEH抑制劑尿蛋白組上述炎癥因子明顯減少(均P0.05),sEH蛋白質(zhì)表達無明顯變化。2.與蛋白尿組相比,EET尿蛋白組MCP-1、IL-6、CSF-1及TNF-α mRNAshu水平明顯減少(均P0.05),但sEH蛋白質(zhì)表達無明顯變化。3.與正常對照組及GFP腺病毒組相比,sEH過表達腺病毒組HK-2細胞sEH蛋白質(zhì)水平及MCP-1、IL-6、CSF-1及TNF-α mRNA水平均明顯增加(P0.05)。4.與正常對照組HK-2培養(yǎng)基處理的巨噬細胞相比,尿蛋白、sEH過表達腺病毒HK-2培養(yǎng)基處理的巨噬細胞及正常對照HK-2培養(yǎng)基外源性加入IFN-γ組巨噬細胞IL-6、iNOSmRNA表達明顯升高(P0.05);與蛋白尿組HK-2培養(yǎng)基處理的巨噬細胞相比,sEH抑制劑+蛋白尿組、尿蛋白HK-2培養(yǎng)基外源性加入EET組及正常對照HK-2培養(yǎng)基外源性加入IL-4組巨噬細胞Arg-1、IL-10 mRNA水平明顯增加(P0.05)。5.與正常對照組HK-2培養(yǎng)基處理的巨噬細胞相比,尿蛋白、sEH過表達腺病毒HK-2培養(yǎng)基處理的巨噬細胞及正常對照HK-2培養(yǎng)基外源性加入IFN-γ組巨噬細胞p-p65蛋白表達明顯升高(P0.05);與蛋白尿組HK-2培養(yǎng)基處理的巨噬細胞相比,sEH抑制劑+蛋白尿組及尿蛋白HK-2培養(yǎng)基外源性加入EET組明顯抑制蛋白尿?qū)-p65上調(diào),促進p-Akt表達(P0.05)。三、結(jié)論上調(diào)腎小管上皮細胞sEH,促進誘導M1型巨噬細胞極化的細胞因子表達;腎小管上皮細胞sEH通過細胞因子及EETs的旁分泌作用,激活NF-κB-p65途徑促進巨噬細胞向M1型極化,抑制PI3K-Akt途徑抑制M2型巨噬細胞極化。抑制sEH后可逆轉(zhuǎn)上述作用。
【圖文】：

冰凍切片鄰片進行ｓＥＨ及ＴＨＰ免疫組化染色。結(jié)果可見丨ｇＡ腎病腎組織ｓＥＨ均逡逑主要表達在ＴＨＰ陰性的近端腎小管胞漿內(nèi)，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)彌漫及顆粒狀分布，逡逑詳見圖１．１。逡逑ｓＥＨ邐ＴＨＰ逡逑■，邐．邋：邐１00｜ｊｒｎ邋＇＊邐ｉｐＯｐｍ逡逑＊邋－邋＊邋＊邋４邐ｒ：：逡逑１主：ｓ＾Ｈ邋（左圖）及ＴＨＰ邋（右圖）免疫組ｆｋ染運，箭頭所ｔｉｉｋ域ｓＥＨ丨柄性，ＴＨＰ陽性。逡逑圖１．１腎組織ｓＥＨ表達定位逡逑根據(jù)ｓＥＨ免疫組化腎小管陽性部位面積分為＋？＋＋＋＋：免疫組化陽性面積達逡逑到０－２５％為＋；免疫組化陽性面積達到２５－５０％為＋＋；免疫組化陽性面積達到５０－７５％逡逑為＋＋＋；免疫組化陽性面積達到７５－１００％為＋＋＋＋，詳見圖１．２。通過免疫組化半逡逑定量分析，發(fā)現(xiàn)ｓＥＨ在ＩｇＡ腎病組腎組織表達（２．６４±０．８９，邋ｎ＝７１）顯著高于逡逑正常對照組（１．００，邋ｎ＝６）邋（ＰＯ．Ｏｌ），詳見表１．１。進一步對正常對照組及ＩｇＡ逡逑１７逡逑

逑腎病組腎組織標本進行Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測，經(jīng)灰度分析并內(nèi)參校對后，，可見ＩｇＡ逡逑腎病組腎組織ｓＥＨ表達明顯高于正常對照組（Ｐ＜０．０５），詳見圖１．３。逡逑＇？邋？邋＞ｔ邐．．、－邋．．．．．．邋ｖ邐７，邐＇＇１邋■邋？ｉ＊邐－邐？．逡逑：Ｍ邋？邐．、邐、邐．邋：逡逑々？邋？，．＿，／，邋，？■？．＊邋．邋？邋－．．＊？＊逡逑２Ｑ0Ｍｍ邐２００｜ｉｎｉ逡逑＋＋＋邐ｖ邋，，邐＋＋＋＋逡逑．邐廣＂Ｖ．Ｗ逡逑？邋ｔ邐ｉ－邐＇逡逑，邋＾邐＿逡逑注：根據(jù)ＳＥＨ免疫組化染色在腎小管陽性的面積，將ＩｇＡ腎病組分為四組，陽性面積逡逑０－２５％為＋；邋２５－５０％為＋＋；邋５０－７５％為＋＋＋；邋７５－１００％為＋＋＋＋。逡逑圖１．２腎組織ｓＥＨ染色及分級標準逡逑Ａ邐Ｂ邐
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R692.31

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本文編號：2607820