發(fā)布時間：2020-03-29 23:37

【摘要】：下尿路癥狀(LUTS)是一種常見的泌尿系統(tǒng)疾病,其患病率隨著年齡的增長而增加。傳統(tǒng)認為,男性LUTS通常被認為是良性前列腺增大而引起的膀胱出口梗阻,后來發(fā)現(xiàn)在許多病例中,男性的LUTS與膀胱出口梗阻無關(guān)。越來越多的證據(jù)表明慢性膀胱缺血在男性和女性的非梗阻性膀胱功能障礙和下尿路癥狀的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。然而,慢性缺血引發(fā)的LUTS和膀胱功能障礙的分子機制尚未完全清楚。蛋白質(zhì)是生命活動的執(zhí)行者和體現(xiàn)者,蛋白組學技術(shù)能直接從蛋白的整體水平反應(yīng)蛋白質(zhì)的動態(tài)變化。通常情況下,蛋白質(zhì)是根據(jù)基因組編碼序列直接翻譯確定的。然而,由于翻譯后修飾,氨基酸替換以及RNA編輯等原因,許多氨基酸殘基往往會發(fā)生改變,它們的相對分子質(zhì)量不同于基因組中的編碼氨基酸,從而改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能,這類氨基酸我們稱之為非編碼氨基酸(ncAAs)。近年來,許多缺血再灌注損傷相關(guān)疾病與蛋白質(zhì)翻譯后修飾密切相關(guān),探究膀胱缺血的分子機制有望從蛋白質(zhì)翻譯后修飾水平上開辟新的道路。本文運用了基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學相關(guān)技術(shù),研究大鼠慢性膀胱缺血中非編碼氨基酸的差異,進一步闡明了慢性膀胱缺血可能的發(fā)病機制,為人類下尿路癥狀的早期診斷和藥物靶向治療提供了理論依據(jù)。研究目的:探討慢性膀胱缺血對膀胱蛋白質(zhì)組中非編碼氨基酸的變化以及缺血相關(guān)修飾蛋白信號通路的特征。研究方法:本研究隨機選取三對雄性大鼠進行雙側(cè)髂動脈阻塞模擬動脈粥樣硬化和慢性膀胱缺血,8周后稱取膀胱組織并進行膠內(nèi)酶解,利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)反復測定獲得高質(zhì)量的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。通過Byonic軟件進行相關(guān)的匹配計算得到所有非編碼氨基酸信息,利用PANTHER、STRING和DAVID數(shù)據(jù)庫進行生物信息學的分析。最后通過缺血性疾病患者的血液樣本進行質(zhì)譜分析,驗證缺血相關(guān)蛋白修飾的差異,為找到人類下尿路癥狀臨床診斷和治療的分子標志物提供理論基礎(chǔ)。實驗結(jié)果:1.大鼠慢性膀胱缺血對不同類型蛋白質(zhì)修飾的影響根據(jù)定義,實際蛋白質(zhì)氨基酸殘基的質(zhì)量與標準編碼氨基酸的質(zhì)量不同的氨基酸殘基為非編碼氨基酸,這些非編碼氨基酸可能是由基因組點突變、RNA編輯、翻譯后修飾甚至還可能存在其他機制。在大鼠慢性膀胱缺血組織中,這些氨基酸上的非零質(zhì)量差改變大部分穩(wěn)定地發(fā)生在缺血和對照組織中,表明在大鼠膀胱蛋白質(zhì)組中存在系統(tǒng)發(fā)生的非編碼氨基酸。這些大量非編碼氨基酸(13039)存在于1549個不同的蛋白質(zhì)位點并分為52種修飾聚類簇。其中,70個蛋白質(zhì)的171個修飾位點上調(diào)或下調(diào)2倍以上(p0.05),這些蛋白稱之為缺血相關(guān)蛋白。在缺血組織中,有17個修飾聚類簇發(fā)生顯著性失調(diào)(R20.2,ratio2倍,p0.05),被認為是潛在的缺血相關(guān)蛋白修飾。在這些修飾中,根據(jù)它們質(zhì)量差大小通過相關(guān)數(shù)據(jù)庫分析得出其中9個與氨基酸的替換有關(guān)。提示這些ncAA的改變可能與缺血密切相關(guān)。2.缺血相關(guān)蛋白的生物信息學分析通過對缺血相關(guān)修飾蛋白的PANTHER功能注釋,這些差異修飾所涉及的蛋白質(zhì)主要有細胞骨架蛋白、結(jié)合蛋白和具有催化功能酶類。STRING預(yù)測了上調(diào)或下調(diào)相關(guān)修飾蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。DAVID分析相關(guān)蛋白參與的信號通路表明,這些缺血相關(guān)蛋白主要參與了血漿血紅素的清除,平滑肌收縮,HSF1依賴的反式激活,血小板胞漿Ca2+升高對血小板脫顆粒反應(yīng),四氫生物蝶呤的合成、回收和調(diào)節(jié)等通路。其中一些通路中的蛋白非編碼氨基酸的改變可能在缺血過程中具有重要的作用。3.缺血過程中上調(diào)和下調(diào)最多的非編碼氨基酸經(jīng)統(tǒng)計分析,在慢性膀胱缺血中共有148個蛋白質(zhì)修飾位點發(fā)生下調(diào),其中下調(diào)倍數(shù)變化最多的為分子量增加14.017 Da的修飾。Val+14.017修飾在慢性膀胱缺血中下調(diào)9倍,且主要發(fā)生在血清白蛋白的431位點。對于膀胱缺血上調(diào)修飾中,上調(diào)倍數(shù)最明顯的蛋白質(zhì)修飾是在血紅蛋白21位點,分子量增加為26.022 Da,根據(jù)它們改變的質(zhì)量差推斷發(fā)生了AlaPro替換。4.慢性膀胱缺血中發(fā)生修飾種類最多的蛋白質(zhì)在慢性膀胱缺血過程中發(fā)現(xiàn)了大量的非編碼氨基酸,它們分布于366個不同的蛋白質(zhì)中,血清白蛋白是發(fā)生頻率最多的差異修飾蛋白。在白蛋白中發(fā)現(xiàn)了30種不同的ncAAs,存在于12種不同類型的非零質(zhì)量差且發(fā)生在26個蛋白質(zhì)位點上,其中發(fā)生的許多修飾都與白蛋白的氧化有關(guān)。5.人類缺血性疾病中缺血相關(guān)修飾蛋白驗證為了驗證大鼠慢性膀胱缺血中白蛋白相關(guān)的氧化修飾是否同樣存在于其他缺血模型中。本文各選取了三名急性心肌梗死患者與健康人的血液進行了質(zhì)譜分析。通過對固定修飾進行搜索,比較了在血清中白蛋白谷胱甘肽化修飾變化。我們的數(shù)據(jù)表明,在人急性心肌梗死疾病中同樣發(fā)生了在白蛋白591位點谷胱甘肽修飾的上調(diào)(ratio2,p0.05),表明了該位點的谷胱甘肽修飾變化與缺血再灌注損傷有關(guān)。結(jié)論:本研究中首次發(fā)現(xiàn)了大量未報道的大鼠慢性膀胱缺血非編碼氨基酸,膀胱蛋白修飾譜在缺血時的改變可能會提供新的線索來了解潛在的分子通路。因此,本文對于了解人下尿路癥狀發(fā)病機制以及靶向藥物的治療具有重要的意義。
【圖文】：

１．２在膀胱缺血組織中氨基酸替換的失調(diào)逡逑在這１７個缺血相關(guān)修飾中，根據(jù)它們質(zhì)量差大小通過相關(guān)數(shù)據(jù)庫查找得出逡逑其中９個與氨基酸的替換相關(guān)。缺血時下調(diào)最多的質(zhì)量差為１４．０１７２邋（Ｒａｔｉｏ＝－１７．５，逡逑ｐ＜０．０１，ｃｏｕｎｔ＝４１８），與Ｄ＞Ｅ，Ｎ＞Ｑ，Ｓ＞Ｔ或Ｖ＞Ｉ／Ｌ氨基酸替換匹配，質(zhì)量誤差小逡逑于０．００２邋Ｄａ。這一質(zhì)量差主要出現(xiàn)在血清白蛋白４３１位點纈氨酸上，通過對基因逡逑組ＤＮＡ和ｃＤＮＡ數(shù)據(jù)庫的比較，發(fā)現(xiàn)其在缺血組織中是由密碼子ＧＴＴ到密碼逡逑子ＡＴＴ的位點突變，表明了邋Ｖ＞Ｉ／Ｌ位點的替換與缺血有關(guān)。逡逑缺血時最豐富且上調(diào)最高的質(zhì)量差為－１５．９７５９邋（Ｒａｔｉｏ＝３．０，邋ｐ＜０．０１，邋ｃｏｕｎｔ＝８５），逡逑與Ｃ＞Ｓ氨基酸替換質(zhì)量差相匹配。這種質(zhì)量差僅存在于血紅蛋白中，在該位點逡逑上，從密碼子ＴＧＴ到密碼子ＴＣＴ的點突變可能會產(chǎn)生Ｃ＞Ｓ氨基酸替換。雖然逡逑在這個位置沒有發(fā)生變異或自然發(fā)生的變異，但這表明了一個新的機制，在缺血逡逑相關(guān)的點突變發(fā)生在ＴＧＴ＞ＴＣＴ，導致血紅蛋白Ｃ＞Ｓ替換發(fā)生上調(diào)。逡逑

結(jié)合蛋白類，參與多種信號通路具有催化活性的酶類。其中轉(zhuǎn)凝蛋白（Ｔａｇｌｎ）、逡逑血清白蛋白（Ａｌｂ）、甘油醛－３－磷酸脫氫酶（Ｇａｐｄｈ）分別位于三類蛋白網(wǎng)絡(luò)的逡逑中心節(jié)點，提示這些分子相關(guān)修飾在缺血過程中可能發(fā)揮著重要作用（圖３ａ）。逡逑在３７個修飾下調(diào)的蛋白質(zhì)中（僅顯示了邋２６個連接的蛋白質(zhì)），由這些蛋白質(zhì)形成逡逑的相互作用網(wǎng)絡(luò)主要分為三個蛋白聚類簇：第一類為細胞骨架和轉(zhuǎn)運蛋白，代表逡逑分子有絲切蛋白（Ｃｆｌｌ）、肌間線蛋白（Ｄｅｓ）、肌球蛋白輕鏈９邋（Ｍｙｌ９）、載逡逑脂蛋白（Ａｐｏａｌ）。第二類為代謝相關(guān)的酶，，代表分子有ＡＴＰ合酶（ＡＴＰ５ａｌ、逡逑ＡＴＰ５ｂ）、泛素羧基末端水解酶ＬＩ邋（Ｕｃｈｌｌ）、磷酸激酶Ｂ邋（Ｃｋｂ）。第三類為逡逑核酸結(jié)合蛋白，代表分子主要為熱休克蛋白家族（Ｈｓｐａｌ、Ｈｓｐｂ６、Ｈｓｐａ８、逡逑Ｈｓｐ９０ａａｌ、Ｃｒｙａｂ）等（圖邋３ｂ）。逡逑ａ．逡逑Ｐｔｒｆ逡逑＿邐Ｃ３逡逑邐邋ｆｒｏｍ邋ｃｕｒａｔｅｄ邋ｄａｔａｂａｓｅｓ逡逑邐ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ邋ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ逡逑邐邋ｇｅｎｅ邋ｎ？ｇｈｂｏｒｈｏｏｄ逡逑ａ—＾Ｃａｌｄｌ邐邐邋ｇｅｎｅ邋ｆｕｓｉｏｎｓ逡逑ｆ邋＼邐—邋ｇｅｎｅ邋ｃｃＫｉｃｃｕｒＴｅｎｃｅ逡逑ＩＰＭ邐邐邋ｌｅｘｌｍｉｎｉｎｇ逡逑邐邋ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ逡逑ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｈｏｍｏｌｏｇｙ逡逑３２逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R694

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本文編號：2606676