【摘要】：目的:研究RCAS1含量升高或降低對于Pca細胞生物學行為的影響,揭示RCAS1在Pca發(fā)生、進展中的作用,初步判斷RCAS1在Pca早期診療中的臨床應用可能,并積極探索RCAS1靶向基因治療的價值。方法:體外培養(yǎng)PC3、LNCaP、C42、DU145等前列腺癌常見細胞系,并通過qPCR及Western Blot檢測RCAS1表達狀態(tài),篩選RCAS1高、低表達細胞系。構建RCAS1高表達質(zhì)粒RCAS1-high并通過基因測序技術確定質(zhì)粒無突變,將RCAS1-high瞬時轉(zhuǎn)染RCAS1低表達細胞系,應用qPCR及Western Blot半定量RCAS1表達量,確定RCAS1-high可在細胞內(nèi)完整表達。購買吉瑪公司shRCAS1質(zhì)粒套餐,篩選出RCAS1高表達細胞并瞬轉(zhuǎn),48h后使用qPCR及Western Blot半定量RCAS1表達量并最終篩選出抑制效應最強的shRCAS1。使用最終確定的shRCAS1及構建成功的RCAS1高表達質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染RCAS1高、低表達細胞系,24-48h后應用muse儀檢測RCAS1-high及shRCAS1對于Pca細胞凋亡、周期方面的改變;使用MTT法檢測RCAS1-high及shRCAS1對于Pca細胞增殖能力的改變;應用transwell法測定RCAS1-high及shRCAS1對于Pca細胞侵襲能力的改變。結果:1、在PC3細胞系中,RCAS1 mRNA及蛋白表達量最低;LNCaP細胞系中,RCAS1 mRNA及蛋白表達量最高,C42中RCAS1 mRNA及蛋白表達量與LNCaP相差不大;2、分別于LNCaP、C42細胞系轉(zhuǎn)染shRCAS1-406、、shRCAS1-561、shRCAS1-598、shRCAS1-690、shRCAS1-NC、shGAPDH,通過qPCR及Western Blot技術篩選出RCAS1抑制作用最強的質(zhì)粒為shRCAS1-406;3、以pFLAG-CMV為基礎質(zhì)粒構建RCAS1高表達質(zhì)粒RCAS1-high,通過雙酶切及基因測序鑒定插入片段大小正確、序列無突變,轉(zhuǎn)染PC3細胞48h后應用qPCR及Western Blot半定量RCAS1豐度,實驗證實RCAS1 mRNA及蛋白表達量顯著升高,RCAS1高表達質(zhì)粒RCAS1-high構建成功;4、轉(zhuǎn)染RCAS1-high 48h后,PC3增殖能力相比Vector組明顯提高,凋亡率相比Vector組明顯下降,RCAS1表達增高可促進PC3由G0/G1期轉(zhuǎn)進S期,transwell實驗顯示PC3侵襲性增強;LNCaP、C42細胞轉(zhuǎn)染shRCAS1-406后,發(fā)現(xiàn)RCAS1表達降低可顯著抑制細胞增殖能力,LNCaP、C42凋亡增加,且G0/G1期比例相比Vector組增加,侵襲性減弱;結論:1、RCAS1在PC3中含量最低,在LNCaP、C42中含量最高;2、成功篩選出RCAS1抑制作用最強的質(zhì)粒為shRCAS1-406;3、成功構建RCAS1高表達質(zhì)粒RCAS1-high;4、RCAS1高表達可顯著增加PC3細胞增殖能力,促進細胞侵襲,顯著抑制細胞凋亡,并促進細胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化;而RCAS1低表達可顯著降低LNCaP、C42增殖,阻礙細胞侵襲,顯著促進細胞凋亡,并促使細胞阻滯在G0/G1期。
【圖文】：

天津醫(yī)科大學碩士學位論文 結果結果2.1 RCAS1/EBAG9 高、低表達細胞系的確立培養(yǎng) PC3、LNCap、C4-2、DU145 等四種前列腺癌細胞系，應用 qPCR 及western blot 等方法檢測各細胞系中 RCAS1/EBAG9 的相對表達量，結果發(fā)現(xiàn) PC3細胞系中 RCAS1/EBAG9 mRNA 及蛋白表達量最低，LNCap、C4-2 細胞系中RCAS1/EBAG9 mRNA 及蛋白表達量最高（如圖 1）。因此，選擇 PC3 細胞系進行 RCAS1/EBAG9 高表 達 實 驗 研究 ， 選擇 LNCap 、 C4-2 細 胞 系 進 行RCAS1/EBAG9 低表達實驗研究。

shRCAS1-690GATGCACCCACCAGTGTAAAGTTCAAGAGACTTTACACTGGTGGGTGCATCTTGGACATGACACCAACTATTAGTTCAAGAGACTAATAGTTGGTGTCATGTCCTT因 LNCap、C4-2 細胞系中 RCAS1/EBAG9 mRNA 及蛋白表達量最高，本實驗選擇 LNCap、C4-2 細胞系轉(zhuǎn)染 shRCAS1 質(zhì)粒套餐，，其中 C4-2 細胞系轉(zhuǎn)染shRCAS1 質(zhì)粒套餐后熒光顯微鏡下觀察，應用 Image J 軟件融合圖像后如圖 2 。shRCAS1-NC shGAPDH shRCAS1-406
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.25

【參考文獻】

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本文編號：2586304