【摘要】：腎臟纖維化是慢性腎臟病進(jìn)展的主要病理生理因素，可緩慢、進(jìn)行性發(fā)展至終末期腎臟病，給社會(huì)及家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。黃芪甲苷(Astragaloside IV,AS-IV)是中藥黃芪的主要有效成分之一，臨床實(shí)踐及現(xiàn)代藥理提示黃芪對(duì)延緩慢性腎臟病進(jìn)展具有顯著作用[1]。目前黃芪甲苷對(duì)腎纖維化的作用尚不明確，本研究圍繞黃芪甲苷對(duì)腎纖維化的作用機(jī)制進(jìn)行探討。 目的：明確黃芪甲苷對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)模型發(fā)生腎臟纖維化的干預(yù)作用，明確黃芪甲苷對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的作用，并初步探討其作用機(jī)制。 方法：雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）（n=8）、模型組（UUO組）（n=10）、黃芪甲苷干預(yù)組（AS-IV組）（n=10）。模型組和黃芪甲苷干預(yù)組均采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）建立腎纖維化模型，Sham組不做輸尿管結(jié)扎余操作相同。黃芪甲苷干預(yù)組在術(shù)后當(dāng)天及其后連續(xù)7天給予AS-IV20mg/(kg×d)灌胃，Sham組及UUO組小鼠同時(shí)給予等量溶劑灌胃。分別于術(shù)后第7、14天采集雙側(cè)腎組織標(biāo)本，記錄腎重及體重。腎組織切片行HE、MASSON染色，觀察病理改變情況。采用TUNEL法檢測(cè)腎組織的細(xì)胞凋亡情況。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（western blotting）及實(shí)時(shí)定量熒光PCR（real-time PCR）法，分別檢測(cè)纖連蛋白(fibronectin)、collagen IV、α-SMA、TGF-β1表達(dá)，并western blotting觀察p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK MAPK蛋白表達(dá)情況。 體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞株（HK2），分為正常組（Ctl）、模型組（TGF-β1）、黃芪甲苷干預(yù)組（AS-IV）。模型組和干預(yù)組均采用TGF-β1（10ng/ml）刺激細(xì)胞，干預(yù)組同時(shí)加入不同濃度的AS-IV（50,100,200ug/ml），刺激后12,24,48h收集各組細(xì)胞。提取細(xì)胞蛋白樣品，western blotting檢測(cè)纖連蛋白、collagen IV、α-SMA表達(dá)情況。CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，并檢測(cè)p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK MAPK信號(hào)蛋白表達(dá)水平。進(jìn)一步研究提前30分鐘給予SB203580(10μM)抑制p38磷酸化，探討并對(duì)比其與AS-IV對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用。 結(jié)果：術(shù)后第14天UUO組小鼠梗阻側(cè)的腎重/體重比值（KW/BW）較對(duì)側(cè)顯著下降（P0.05），而AS-IV干預(yù)后可緩解KW/BW的縮�。≒0.05）。與Sham組相比，術(shù)后第14天梗阻側(cè)腎臟的病理學(xué)表現(xiàn)出多處腎小管間質(zhì)纖維化改變，同時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，UUO組第14天梗阻腎組織纖連蛋白、collagen IV、α-SMA、TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)增多（均P0.05），AS-IV組梗阻側(cè)腎臟纖維化改變顯著減輕（P0.05），纖連蛋白、collagen IV、α-SMA、TGF-β1表達(dá)量較模型組減少（均P0.05）。UUO組梗阻側(cè)腎臟細(xì)胞凋亡較Sham組顯著增加（P0.05），術(shù)后14天AS-IV組的細(xì)胞凋亡程度較UUO組減輕（P0.05）。UUO組p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK MAPK均表達(dá)增高（均P0.05），而黃芪甲苷干預(yù)顯著改善MAPK信號(hào)蛋白的激活（均P0.05）。 TGF-β1刺激后出現(xiàn)細(xì)胞活性下降（P0.05），細(xì)胞凋亡增多（P0.05），纖連蛋白、collagen IV、α-SMA表達(dá)水平增高（均P0.05），p-p38/p38、p-JNK/JNK蛋白表達(dá)增多（均P0.05），，而p-ERK/ERK未見(jiàn)明顯改變。而黃芪甲苷干預(yù)可顯著改善細(xì)胞活性（P0.05），減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生（P0.05），減少纖連蛋白、collagen IV、α-SMA蛋白表達(dá)（均P0.05）。同時(shí)AS-IV干預(yù)降低p-p38/p38、p-JNK/JNK水平（均P0.05）。提前給予SB03580抑制p38磷酸化，同樣表現(xiàn)出collagen IV、α-SMA表達(dá)的減少（均P0.05）。 結(jié)論：AS-IV可改善UUO和TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)展和減少細(xì)胞凋亡。黃芪甲苷的抗纖維化作用，可能是通過(guò)抑制p38、JNK MAPK信號(hào)通路活化，減少腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而發(fā)揮改善腎小管間質(zhì)纖維化的作用。
【圖文】：

護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[13]。黃芪甲苷抑制豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化，膠原蛋白合成，降低肝 TGF-β1 表達(dá)，抑制星狀細(xì)胞過(guò)度增來(lái)越多的研究指出，黃芪甲苷在各種腎損傷模型中具有特i 等發(fā)現(xiàn)[16]，黃芪甲苷可改善腎缺血再灌注及順鉑誘導(dǎo)的急激反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡，從而產(chǎn)生腎保護(hù)作用。Qi 等[17小管上皮損傷，黃芪甲苷干預(yù)可特異性減輕腎近端小管細(xì)善小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生。我們的前期實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)[20]細(xì)胞分泌 TGF-β1，促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子及其受體（c-m管上皮細(xì)胞凋亡，從而減輕高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞芪甲苷對(duì)腎小管間質(zhì)纖維化的作用尚缺乏足夠研究證據(jù)與腎纖維化的作用展開(kāi)研究，并提出假設(shè)：黃芪甲苷可能保護(hù)作用，部分抑制細(xì)胞凋亡，改善后期腎小管間質(zhì)纖維

上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文(c-jun N-terminal kinase, JNKs)和 p38 絲裂原活化蛋白激酶 (p38 MAPK)。JNK和 p38 MAPK 信號(hào)被認(rèn)為可能是參與腎纖維化進(jìn)程的重要通路[23, 24]。在小鼠腎動(dòng)脈狹窄的模型中[25]，使用 SB203580（p38 MAPK 抑制劑）可有效抑制腎纖維化的進(jìn)展。因此，本研究提出假設(shè)：黃芪甲苷對(duì)腎小管的保護(hù)作用，是否通過(guò)調(diào)節(jié) MAPK 信號(hào)通路起作用？黃芪甲苷是否通過(guò) MAPK 通路改善腎纖維化？（見(jiàn)圖 2）
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R692

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2581201