【摘要】：IgA腎病(IgA nephropathy, IgAN)是以出現(xiàn)鏡下血尿或肉眼血尿或蛋白尿、血清IgA水平升高、腎臟病理顯示腎小球系膜區(qū)IgA免疫復(fù)合物沉積,導(dǎo)致系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積為特征的一類腎小球腎炎。目前認(rèn)為IgA腎病在世界各地都是原發(fā)性腎小球腎炎中最常見(jiàn)的類型,在確診后5～25年內(nèi),約20%-40%的患者不可逆地進(jìn)展為終末期腎病(end-stage renal disease, ESRD)。本課題重點(diǎn)研究了雷帕霉素在IgA腎病大鼠模型中的治療效果及作用機(jī)制,同時(shí)探討雷帕霉素抑制系膜細(xì)胞增殖的機(jī)制以及對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK1/2的影響。 第一部分雷帕霉素治療IgA腎病大鼠療效觀察及機(jī)制研究 目的：IgA腎病(IgAN)是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的腎小球腎炎,因其發(fā)病機(jī)制不清,所以臨床上嘗試不同的治療方法。本研究旨在探討低劑量mTOR抑制劑雷帕霉素對(duì)IgA腎病大鼠模型的潛在的保護(hù)能力及可能的作用機(jī)制,為臨床治療IgA腎病提供新思路。 方法：首先我們建立IgA腎病大鼠模型,大鼠分為4組：正常對(duì)照組(control)正常對(duì)照+雷帕霉素組(control+Rapa)、IgA腎病組(IgAN)、IgA腎病組+雷帕霉素組(IgAN+Rapa)每組10只；雷帕霉素(1mg/kg/d)灌胃給藥,持續(xù)4周,對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃。每周測(cè)各組大鼠體重；分別于4、8、12、16周末,用代謝籠收集各組大鼠24小時(shí)尿液,采用麗春紅S法檢測(cè)24小時(shí)尿蛋白；16周末處死大鼠,分離血清,取材。采用DxC800型自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各項(xiàng)生化指標(biāo)；冰凍切片免疫熒光觀測(cè)IgA沉積；HE、PAS、Massion染色后進(jìn)行腎組織形態(tài)學(xué)分析;BrdU檢測(cè)系膜細(xì)胞的增殖；免疫組化法及Real-time PCR檢測(cè)腎皮質(zhì)TGF-β1、PDGF-B、α-SMA、CollagensⅠ和Ⅲ蛋白及mRNA的表達(dá)；最后我們用免疫組化及Western blotting檢測(cè)了腎皮質(zhì)pS6蛋白表達(dá)。 結(jié)果：1)雷帕霉素可以減少蛋白尿,預(yù)防血肌酐升高,同時(shí)對(duì)大鼠體重及肝功能無(wú)影響；2)雷帕霉素直接或間接干擾IgAN發(fā)展為終末期腎病(ESRD)的多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)：①減少了IgA的沉積、抑制系膜細(xì)胞增殖；②減少IgA腎病大鼠系膜細(xì)胞a-SMA表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)collagenⅢ的分泌；③下調(diào)促纖維化生長(zhǎng)因子PDGF-B和TGF-β1的表達(dá)。3)IgA腎病大鼠中pS6表達(dá)升高,說(shuō)明mTORC1信號(hào)通路被激活,S6磷酸化為pS6；雷帕霉素作為mTORC1的特異抑制劑,可以阻斷其激活,抑制S6磷酸化。 結(jié)論：在IgA腎病大鼠中mTOR通路被激活,早期小劑量應(yīng)用mTOR抑制劑雷帕霉素可阻斷mTOR通路；同時(shí)雷帕霉素減少蛋白尿及IgA的沉積,抑制腎小球系膜細(xì)胞(MC)增殖、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分泌及三者之間的相互作用,從而減緩IgA腎病大鼠的腎損傷。 第二部分雷帕霉素抑制大鼠系膜細(xì)胞增殖的機(jī)制研究 目的：IgA腎病以系膜細(xì)胞增殖為主要病理特點(diǎn),所以我們培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞,研究雷帕霉素抑制系膜細(xì)胞增殖的機(jī)制,以及其對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K/Akt/mTOR和MAPK/ERK1/2的影響。 方法：常規(guī)培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞,分為control組、PDGF組、RAPA1nmol/L組、RAPA10nmol/L組、RAPA100nmol/L組、RAPA1000nmol/L組,MTT法檢測(cè)24h、48h細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡；蛋白提取及Western blotting分析腎皮質(zhì)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E、CDK2及CDK4表達(dá);Western blotting及RT-PCR檢測(cè)p27蛋白及mRNA表達(dá)量;Western blotting分析信號(hào)傳導(dǎo)通路蛋白p-P70S6K/P70S6K、p-AKT/AKT、p-ERK1/2/ERKl/2的表達(dá)量。 結(jié)果：1)雷帕霉素呈劑量依賴性的抑制PDGF引起的系膜細(xì)胞增殖,阻斷細(xì)胞周期在G1期,但100nmol/L與1000nmol/L組并未見(jiàn)明顯差異；雷帕霉素不影響系膜細(xì)胞的凋亡；2)雷帕霉素不影響PDGF組上調(diào)的Cyclin D1、E及CDK2、4表達(dá)量；但可以通過(guò)調(diào)控mRNA的轉(zhuǎn)錄,增加p27蛋白表達(dá)；3)雷帕霉素劑量依賴性的抑制PDGF引起的P70S6K磷酸化,1000nmol/L抑制作用最強(qiáng)；10nmol/L及100nmol/L雷帕霉素對(duì)PDGF刺激升高的p-AKT及p-ERK1/2均未見(jiàn)顯著影響,1000nmol/L干預(yù)時(shí),p-AKT、p-ERK1/2較10及100nmol/L組的蛋白表達(dá)量略有升高。 結(jié)論：雷帕霉素通過(guò)mTORCl/P70S6K通路調(diào)控p27mRNA轉(zhuǎn)錄,增加其蛋白表達(dá),從而抑制cyclin E-CDK2的活性,阻斷細(xì)胞周期由G0-G1期進(jìn)入S期,抑制細(xì)胞的增殖；在大鼠系膜細(xì)胞中,大劑量使用雷帕霉素(1000nmol/L)可能會(huì)反饋激活A(yù)KT及Ras/Raf/ERK,從而減弱雷帕霉素抑制細(xì)胞增殖的效果。
【圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 結(jié)果、IgA腎病大鼠動(dòng)物模型的建立.1 IgA免疫熒光沉積正常對(duì)照組在第6周及12周末大鼠腎組織均未見(jiàn)明顯的IgA沉積，焚光強(qiáng)一?±; IgA腎病大鼠第6周末系膜區(qū)開(kāi)始出現(xiàn)顆粒狀的IgA沉積,勞光強(qiáng)度為-++, 12周末IgA沉積顯著，呈連續(xù)性片狀沉積，焚光強(qiáng)度達(dá)到+++?++++。6 week 12 week

圖1.1-3各組大鼠體重增長(zhǎng)情況（3^±s，g)帕霉素明顯減少24h尿蛋白量模前各組大鼠蛋白尿定性陰性，在造模第4周末開(kāi)始出現(xiàn)少量的尿蛋白，照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05);此后，模型組尿蛋白持續(xù)升高，末達(dá)到19.38±4.25mg/24h;與對(duì)照組比較有顯著差異（尸<0.01); 16周末，，組蛋白尿仍繼續(xù)增長(zhǎng)至32.61±6.46mg/24h，而RAPA干預(yù)治療4周后，模的尿蛋白由22.00±3.98 mg/24h降低至15.52±2.76 mg/24h,但仍高于對(duì)照組2±0.33 mg/24h，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（尸<0.01)。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R692.31

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2578105