【摘要】：前列腺癌是男性多發(fā)的惡性腫瘤，且其在全世界的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。早在1941年，雄激素在前列腺癌（Prostate Cancer,PCa）中的作用首先是由Huggins等闡述的。他們注意到前列腺腫瘤的體積在去除雄激素之后縮小。從此之后，去除雄激素已經(jīng)成為了治療早期前列腺癌的主要方法。在治療的初期，，由于引發(fā)細胞凋亡，腫瘤的質(zhì)量不斷的減小。然而不幸的是，前列腺癌通常在治后的18 36個月中復發(fā)，并且惡化成為去勢抗性的前列腺癌(Castration-resistantprostate cancer,CRPC)。在CRPC中，雄激素受體（Androgen Receptor，AR）的狀態(tài)因雄激素處于去勢的水平下而活化，通常也伴隨著AR的表達量亦開始上升，通常此時的AR對雄激素高度地敏感，且AR的活性能被一些非經(jīng)典通路所激活，或者是處于組成型的激活狀態(tài)。迄今為止，臨床上針對前列腺癌的治療尚沒有突破性的進展。因此，探究并闡明前列腺癌細胞的生長過程中其復雜的分子機制，并且提出靶向有效的診斷、治療方法，將是目前及未來亟待解決的科學問題。 雄激素受體AR是類固醇激素受體家族的一員，該家族的其他成員還包括雌激素，孕酮，鹽皮質(zhì)激素以及糖皮質(zhì)激素。AR能夠通過調(diào)控細胞存活、增殖、分泌作用及凋亡，在前列腺、良性的前列腺增生以及前列腺癌的惡性程度進展中發(fā)揮重要的作用。雄激素受體AR是一個由919個氨基酸組成的蛋白，基因全長約180kb，位于編號為Xq11-12的染色體上。AR是由三個主要的功能區(qū)域組成的。其中最大的氮端區(qū)域(N-terminal domain,NTD)包含了半數(shù)以上的受體部分，并且含有兩個激活功能區(qū)(activation function,AF)之一。AR中的第二個功能域是DNA結(jié)合區(qū)域(DNA binding domai,DBD)，其中包含了兩個鋅指結(jié)構(gòu)。另一個轉(zhuǎn)錄激活配體結(jié)合區(qū)(ligand binding domain,LBD)通過一段短的靈活的肽序列構(gòu)成的鉸鏈區(qū)與DBD連接。 PC-1基因(Prostate and Colon gene1)是由周建光研究員等篩選并且克隆出的新基因，該基因的表達量在雄激素依賴的、非轉(zhuǎn)移的早期前列腺癌細胞系LNCaP中較低，而在雄激素非依賴的、可轉(zhuǎn)移的晚期前列腺癌細胞系C4-2中較高。PC-1蛋白由224個氨基酸組成，屬于TPD52（Tumor Protein D52）癌蛋白家族，PC-1與D52家族的蛋白高度同源的序列有180個氨基酸，位于C端，而PC-1蛋白的特異性區(qū)域則是其位于N端的46個氨基酸。前期研究提示我們，PC-1基因在前列腺癌中所發(fā)揮的特異性的作用可能源于其癌基因的身份。然而，目前對于PC-1發(fā)揮生物學功能詳細的分子機制，以及其在前列腺癌臨床治療中的作用尚不明確。因此在本文中，為了探究在前列腺癌細胞中PC-1基因的表達在其發(fā)生發(fā)展的過程中所起的作用及其分子機制，我們進行了系列實驗，并取得了以下的幾項進展： （1）首先在非前列腺癌細胞293T瞬時轉(zhuǎn)染PC-1與AR質(zhì)粒，通過western blot檢測到PC-1與AR蛋白量之間的相關(guān)性：PC-1過表達時，AR蛋白量降低，且呈劑量效應(yīng)。然后，構(gòu)建過表達PC-1的雄激素依賴的前列腺癌LNCaP穩(wěn)定細胞系及敲低PC-1表達的雄激素非依賴的前列腺癌C4-2穩(wěn)定細胞系，再次驗證了PC-1與AR蛋白表達量呈負相關(guān)性。接著，用放線菌酮(Cycloheximide,CHX)來抑制AR的蛋白合成后發(fā)現(xiàn)在PC-1存在時能使AR蛋白的半衰期縮短。所以從蛋白降解經(jīng)典通路泛素-蛋白酶體通路角度研究，AR蛋白的泛素化實驗證明了PC-1是通過蛋白酶體通路來調(diào)控AR蛋白水平的。 （2）為探究PC-1與AR之間的相關(guān)性是否是通過兩者間直接的相互作用導致的。通過GST-pull down實驗及免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)外源或Qg源表達的PC-1與AR之間均存在蛋白質(zhì)之間的相互作用，且能與PC-1發(fā)生相互作用的區(qū)段是AR的第629-634位的鉸鏈區(qū)。 （3）上述結(jié)果表明，PC-1是通過與AR的第629-634位的鉸鏈區(qū)發(fā)生蛋白質(zhì)間相互作用，最終通過蛋白酶體通路來調(diào)控AR蛋白水平的。相關(guān)體外實驗也證實了CHIP(carboxy terminus of Hsc70interacting protein，C末端Hsp/Hsc70交互作用蛋白)能夠發(fā)揮E3泛素連接酶的作用。為研究PC-1是否是通過CHIP這一新的E3泛素化連接酶來調(diào)控AR的蛋白量有待研究。通過GST-pull down實驗及外源、內(nèi)源免疫共沉淀實驗，分別從正向或反向檢測到PC-1、CHIP及AR三者之間存在蛋白質(zhì)之間的相互作用，并且PC-1過表達能增強AR和CHIP蛋白之間的相互作用，進而增強CHIP參與的AR泛素-蛋白酶體降解的過程。 （4）通過在293T細胞中外源轉(zhuǎn)染PC-1、AR和CHIP質(zhì)粒，進行western blot實驗從蛋白量水平上，研究發(fā)現(xiàn)在PC-1與CHIP共同協(xié)作時，AR的蛋白量比它們單獨存在時要低。且將293細胞的內(nèi)源性CHIP蛋白通過RNAi技術(shù)敲低后，過表達PC-1不能使AR蛋白量下降。利用AR蛋白泛素化實驗，證明PC-1能促進CHIP介導的AR的泛素-蛋白酶體降解過程。 （5）本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)PC-1能夠在細胞周期G2/M期中高表達。通過諾考達唑(Nocodazole)、2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol,2-ME)將細胞進程阻滯在細胞周期的G2/M期時，PC-1過表達能使AR與CHIP蛋白量的降低程度增加。表明，PC-1能夠協(xié)同CHIP參與G2/M期AR的降解。然而具體的作用機制尚未清楚，有待進一步研究。 （6）用LNCaP和PC3作為前列腺癌細胞模型,進行雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒匝芯縋C-1能夠發(fā)揮的生物學意義。結(jié)果表明，PC-1能夠抑制AR的轉(zhuǎn)錄激活功能。 總之，本研究從分子水平上研究了PC-1基因在前列腺癌的發(fā)展中所起的作用及機制。為確立PC-1基因作為前列腺癌新的治療靶標提供了分子生物學基礎(chǔ)。
【圖文】：

本實驗室前期研究提示我們，PC-1 與 AR 之間可能存在著某種必然的聯(lián)系為此，進行如下的實驗進行驗證。1.1 293 細胞中 AR 與 PC-1 蛋白相關(guān)性的驗證為了初步鑒定 PC-1 與 AR 蛋白之間是否存在相關(guān)性，首先在 293 細胞中瞬時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 Myc-AR 與 HA-PC-1 或 HA 空載體，提取蛋白，進行 western blot 檢測 AR 及 PC-1 的蛋白量，以γ-tubulin 為內(nèi)參，結(jié)果如圖 1.1A，PC-1 過表達的情況下，AR 蛋白量降低。為進一步研究 PC-1 對于 AR 蛋白量的影響，將一定量Flag-AR 及梯度劑量的 HA-PC-1 轉(zhuǎn)染進 293 細胞中，提取蛋白，檢測 AR 及 PC-的蛋白量，結(jié)果如圖 1.1B，再次印證，PC-1 高表達能夠調(diào)控 AR 蛋白表達水平且發(fā)現(xiàn) PC-1 的這種作用具有濃度梯度效應(yīng)。A B

碩士學位論文LNCaP穩(wěn)定細胞系，以及PC-1敲低表達的C構(gòu) 建 好 的 pCDH-EF1-Myc-PC-1-PuroMCS-Puro，PC-1 shRNA及對照質(zhì)粒pSIH1出慢病毒后分別感染前列腺癌LNCaP和C4-2提取總蛋白，用Western印跡檢測細胞內(nèi)P ， 結(jié) 果 見 圖 1.2 。 相 對 于 各 自 的 對PC-1-Puro慢病毒的LNCaP細胞中的PC-1蛋 shRNA慢病毒的C4-2細胞中的PC-1蛋白表CaP-Control、LNCaP-PC-1、C4-2-Control、
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.25

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 顧方六;Changing constituents of genitourinary cancer in recent 50 years in Beijing[J];Chinese Medical Journal;2003年09期

本文編號：2577207