【摘要】：腎纖維化是各種慢性腎臟病(CKD)向終末期腎臟病(ESRD)進展的共同通路,而炎癥是纖維化發(fā)生發(fā)展的重要機制。在炎癥相關的眾多細胞和因子中,巨噬細胞在纖維化發(fā)生發(fā)展中起著極其重要的作用,其活化狀態(tài)不同作用不盡相同。淋巴管是炎癥領域的新熱點,除在生理狀態(tài)下參與維持體液平衡、吸收營養(yǎng)物質,還在腫瘤遷移、移植排斥、損傷修復等多種病理狀態(tài)發(fā)生重要作用。各種組織中,巨噬細胞通過直接和間接機制參與淋巴管新生,調節(jié)炎癥反應；而巨噬細胞成熟分化被認為與自噬有關,經典促淋巴管生長因子血管內皮生長因子C(VEGF-C)據(jù)報道可以調節(jié)自噬。近來有報道淋巴管新生與腎纖維化有關。因此我們推測,巨噬細胞與腎纖維化淋巴管新生之間存在密切聯(lián)系,其機制與自噬有關。在本研究中,我們通過體內外實驗探討腎間質中淋巴管新生與纖維化和巨噬細胞浸潤的關系,以及巨噬細胞參與淋巴管新生機制。我們研究發(fā)現(xiàn)在不同纖維化模型中均存在巨噬細胞浸潤、淋巴管新生和腎臟纖維化,且淋巴管新生與纖維化程度和巨噬細胞浸潤呈正相關。同時我們發(fā)現(xiàn)巨噬細胞經典活化型(M1)比替代活化型(M2)和靜息型(M0)更可能分化為淋巴管內皮細胞(LEC),且VEGF-C可以促進M1分化,轉分化為LEC潛能增加：抑制VEGF-C/VEGFR3通路后,可以逆轉此效應。而VEGF-C能夠抑制巨噬細胞自噬,抑制VEGF-C/VEGFR3通路增加巨噬細胞自噬。自噬誘導劑雷帕霉素也會削弱巨噬細胞向M1分化,降低其分化為LEC潛能。綜上所述,腎纖維化中VEGF-C通過下調巨噬細胞自噬,使之向M1分化增加,進一步增強轉分化為LEC潛能,促進淋巴管新生。第一部分腎纖維化中淋巴管新生與巨噬細胞浸潤的關系目的研究小鼠腎纖維化模型中淋巴管新生情況,及其與間質浸潤巨噬細胞和纖維化的關系。方法構建小鼠單側輸尿管梗阻(UUO)和阿霉素腎病(ADR)纖維化模型,Masson染色觀察腎纖維化程度,免疫組化、Western blot和realtime PCR檢測纖維化(α-SMA、 Collagenl、PDGFR)、巨噬細胞F4/80、淋巴管生成(LYVE-1、Prox-1、VEGF-C);免疫熒光雙標檢測F4/80和LYVE-1。對UUO模型使用氯膦酸鹽脂質體(clodronate liposome)耗竭巨噬細胞,對照使用空載脂質體(liposome PBS)和PBS,收集標本后檢測上述各項指標。結果在假手術組和對照組,Masson染色未見膠原纖維,α-SMA、CollagenⅠ、PDGFR-β、 F4/80、LYVE-1、Prox-1和VEGF-C低表達；在UUO和ADR模型中,Masson染色可見腎間質明顯纖維化,α-SMA、CollagenⅠ、PDGFR-β、F4/80、LYVE-1、Prox-1和VEGF-C表達明顯增加,且隨病程延長而增加。用imagepro plus軟件對模型組α-SMA、F4/80、LYVE-1和VEGF-C免疫組化染色定量及相關性分析后發(fā)現(xiàn)LYVE-1表達與VEGF-C、α-SMA和F4/80的表達均為正相關。Clodronate liposome干預UUO后,Masson染色示纖維化明顯減輕,α-SMA、Collagenl、PDGFR-β、F4/80、LYVE-1、 Prox-1和VEGF-C的表達均大幅下降。而F4/80和LYVE-1在纖維化模型中存在共定位。結論間質淋巴管新生與纖維化程度和巨噬細胞浸潤數(shù)量均成正相關,在腎臟纖維化中巨噬細胞可能直接轉分化入淋巴管內皮細胞形成淋巴管結構。第二部分腎纖維化中巨噬細胞通過VEGF-C/VEGFR3通路轉分化為淋巴管內皮細胞目的驗證巨噬細胞轉分化為淋巴管內皮細胞形成淋巴管結構的能力和機制方法分離培養(yǎng)小鼠骨髓來源單核巨噬細胞,不加刺激為M0,加入IFN-y/LPS誘導為經典活化型巨噬細胞(M1),加入IL-4/IL-13誘導為替代活化型巨噬細胞(M2)；用光學顯微鏡觀察形態(tài),Western blot檢測iNOS和Arginase, realtime PCR檢測iNOS、 Arginase、TNF-α、CD206、YM-1和FIZZ-1,流式細胞術檢測Dectin-1、MHC-Ⅱ和CD86,免疫熒光檢測iNOS和CD206,鑒定巨噬細胞表型；鑒定成功后,用VEGF-C分別刺激M0/M1/M2,對M1使用Lipofectamine RNAimax轉染VEGF-C的SiRNA或者VEGFR3的抑制劑SAR131675,多種方法檢測LYVE-1、Prox-1、Podoplanin, VEGFR3、VEGF-C、iNOS、CD206、Arginase;將M0/M1/M2(有或無VEGF-C刺激)分別培養(yǎng)于生長因子減少型Matrige1中,用EBM-2培養(yǎng)基進行三維培養(yǎng),每天用倒置光學顯微鏡觀察；將M1/M2用或不用VEGF-C刺激后,以DiI標記,尾靜脈回輸至UUO和ADR內,收取標本后,用腎組織冰凍切片直接觀察紅色熒光,并用熒光檢測DiI與LYVE-1或F4/80共定位。結果提取分化的三型細胞中,M0形態(tài)較圓：M1輪廓不清、有大量鞭毛,高表達iNOS、 TNF-α MHC-Ⅱ和CD86；M2細胞較肥大、更長,高表達Arginase、CD206、Dectin-1、YM-1和FIZZ-1；說明分離及誘導分化培養(yǎng)成功。Western blot、免疫熒光和realtime PCR結果顯示M1表達LYVE-1、Pro x-1和Podoplanin明顯高于M0/M2, LYVE-1、Podoplanin與iNOS共定位,與CD206不存在共定位；加入VEGF-C后,M1表達iNOS、LYVE-1、 Prox-1和Podoplanin進一步增加,此效應可被VEGF-C-siRNA或者VEGFR3的抑制劑SAR131675消除。與此一致的是,無論在體外三維培養(yǎng)還是回輸至纖維化模型中,M1比M0/M2生成更多淋巴管樣結構,且DiI-M1與F4/80和LYVE-1存在共定位。結論M1高表達淋巴管標記物,在體外和體內都能轉分化為淋巴管內皮細胞,形成管樣結構或者成為淋巴管結構一部分;VEGF-C能夠促進M1標記物增加,轉分化能力更強,而沉默VEGF-C和VEGFR3抑制劑SAR131675能下調M1表型標記物,削弱其轉分化為淋巴管的能力。第三部分VEGF-C/VEGFR3通路調控巨噬細胞自噬促進其向淋巴管內皮細胞轉分化的機制目的探索VEGF-C介導的自噬在巨噬細胞轉分化為淋巴管內皮細胞中的作用和機制方法體外實驗中,用VEGF-C分別刺激M0/M1/M2,在M1使用Lipofectamine RNAimax轉染VEGF-C-siRNA或者VEGFR3抑制劑SAR131675,免疫熒光和Western blot檢測LC3和p62;用雷帕霉素分別刺激M0/M1/M2, Western blot檢測LC3、p62、 iNOS、Arginase、LYVE-1、Prox-1和Podoplanin。體內實驗中,免疫熒光雙標檢測UUO和ADR組織中F4/80和LC3；雷帕霉素干預UUO后,流式細胞術檢測腎臟F4/80+ CDllb+CD86+MHC-Ⅱ+M1型巨噬細胞比例和F4/80+CD11b+ Podoplanin+細胞的比例。結果在UUO和ADR中,巨噬細胞存在不同程度自噬。免疫熒光和Western blot顯示M1低表達LC3Ⅱ/Ⅰ,高表達p62; VEGF-C可分別使M0/M1/M2上LC3Ⅱ/Ⅰ降低,p62升高；Western blot顯示VEGF-C的siRNA或者VEGFR3的抑制劑SAR131675可消除此效應。雷帕霉素分別刺激M0/M1/M2后,LC3Ⅱ/Ⅰ均上調,p62、iNOS、Prox-1、 Podoplanin和LYVE-1下調;而雷帕霉素干預UUO模型后,F4/80+CDllb+CD86+ MHC-Ⅱ+M1型巨噬細胞和F4/80+CD11 b+Podoplanin+細胞在F4/80+CD11b+細胞中比例均下降。結論VEGF-C可以通過下調巨噬細胞自噬,促使巨噬細胞向M1分化增加,表達淋巴管內皮細胞標記增加,用自噬誘導劑刺激巨噬細胞后,出現(xiàn)相反的效果。我們研究結果說明VEGF-C/VEGFR3調控巨噬細胞自噬在巨噬細胞向淋巴管轉分化中扮演了重要角色,為纖維化中干預炎癥反應提供新思路。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R692

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