【摘要】：研究背景 蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)之間高度有序的相互作用,決定了細(xì)胞的命運(yùn),如增殖、分化或死亡。蛋白質(zhì)之間的相互作用嚴(yán)格控制著DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、大分子物質(zhì)的聚集與降解,以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程等。蛋白質(zhì)相互作用是所有生物體保持正常生理功能的基礎(chǔ)。而許多疾病的發(fā)生與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的改變密切相關(guān)。 許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用是由銜接蛋白所介導(dǎo)。Nck家族蛋白屬于一類重要的銜接蛋白。在哺乳動物中,它有兩個家族成員Nck-1和Nck-2,主要由N端的三個SH3結(jié)構(gòu)域和C端的一個SH2結(jié)構(gòu)域組成。Nck是WASP家族蛋白的一個重要的結(jié)合蛋白。在細(xì)胞內(nèi)Nck與無活性的N-WASP相互作用,當(dāng)Nck與細(xì)胞表面受體結(jié)合后激活細(xì)胞內(nèi)的GTP-Cdc42和PIP2,活化的GTP-Cdc42或者PIP2與WASP結(jié)合后,打破WASP的自身鉸鏈閉合結(jié)構(gòu)。而啟動細(xì)胞骨架重排的關(guān)鍵是肌動蛋白纖維的成核反應(yīng)。肌動蛋白纖維的成核反應(yīng)受Arp2/3復(fù)合物的催化,而Arp2/3復(fù)合物成核活性受WASP蛋白家族成員的調(diào)控。Nck家族蛋白可以通過其SH2結(jié)構(gòu)域接受細(xì)胞內(nèi)、外酪氨酸磷酸激酶信號,再通過其SH3結(jié)構(gòu)域與WASP-Arp2/3復(fù)合物的相互作用將信號的作用傳遞至細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò),從而介導(dǎo)酪氨酸磷酸激酶信號對細(xì)胞形態(tài)以及細(xì)胞運(yùn)動能力的調(diào)控作用。另一方面,SH3結(jié)構(gòu)域還能與neural Wiskott Aldrich syndromeprotein(N-WASP), WASP-interactin protein(WIP)以及PAK絲氨酸／蘇氨酸激酶等相互結(jié)合調(diào)控細(xì)胞骨架活動。 Way等通過位于牛痘病毒細(xì)胞表面的一個跨膜蛋白A36R,與酪氨酸激酶Src相互作用后活化Src,活化的Src進(jìn)一步磷酸化A36R第112位點(diǎn)的酪氨酸,A36R通過該位點(diǎn)與Nck的SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合,從而通過:Nck-WASP-Arp2/3復(fù)合物引起細(xì)胞骨架的重排,促進(jìn)牛痘病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的傳播。另外,有研究者證實(shí)Nck-1與受體酪氨酸激酶EGFR, PDGFR-β形成復(fù)合物,而且Nck-1的SH2結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)介導(dǎo)其間的相互作用。新近的研究發(fā)現(xiàn),Src家族酪氨酸磷酸激酶可以磷酸體(?)Nephrin位于胞內(nèi)部分的三個酪氨酸位點(diǎn),磷酸化的Nephrin與Nck的SH2結(jié)構(gòu)域相互作用,進(jìn)而通過WASP-Arp2/3復(fù)合物與細(xì)胞骨架系統(tǒng)相連。對足細(xì)胞足突的形成和維持具有重要作用。而敲除Nck基因,破壞Nck與nephrin之間的相互作用導(dǎo)致足細(xì)胞足突消失和大量蛋白尿,與芬蘭型遺傳性腎病綜合征患者的表現(xiàn)完全一樣。 我們通過GST-Nck-1-SH2的融合蛋白體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)以及質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)13種可能與其結(jié)合的蛋白。其中包括ELMO1。ELMO1(Engulfment cell motility1)是一種進(jìn)化上保守的蛋白,調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動和吞噬作用。在正常小鼠腎臟中,ELMO1在腎小管及腎小球上皮細(xì)胞有弱表達(dá)。然而在單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)模型,糖尿病腎病模型和慢性腎炎模型中則發(fā)現(xiàn)有明顯升高。在COS細(xì)胞株中,過表達(dá)ELMO1,發(fā)現(xiàn)collagenl和fibronectin基因及蛋白表達(dá)顯著增加。但具體機(jī)制不甚清楚。 ELMO1與Dock180形成復(fù)合物,作為Rac的GEF(鳥苷酸交換因子),特異性激活Rac1(Ras相關(guān)的C3肉毒桿菌底物蛋白)。Rac1屬于小GTP酶的Rho家族的成員。Rac1廣泛分布于各種組織,其上有GTP酶結(jié)合區(qū),表現(xiàn)出GTP酶活性,可在活性型GTP結(jié)合形式和限制型或失活型GDP結(jié)合形式兩種構(gòu)象之間進(jìn)行循環(huán)。在受到細(xì)胞外信號的刺激作用下,Rac1通過鳥苷酸交換因子(GEFs)可以從GDP結(jié)合形式轉(zhuǎn)變成GTP結(jié)合的活化形式。在GTP酶激活蛋白(GAPs)作用下,Rac1-GTP失去一個磷酸基團(tuán),成為Rac1-GDP的失活形式。GTP酶在有活性的三磷酸鳥苷GTP與無活性二磷酸鳥苷GDP兩種構(gòu)象之間的循環(huán)過程起著多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的“分子開關(guān)”作用。正是這兩種活性形式之間的轉(zhuǎn)換構(gòu)成了Rac1發(fā)揮生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。 研究表明,小G蛋白Rho家族成員在所有真核細(xì)胞中都發(fā)揮著調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的作用。Rac1可通過與胰島素受體酪氨酸激酶p53(IRSp53)結(jié)合,進(jìn)而與WAVE2-Abi1結(jié)合,形成Racl-IRSp53-WAVE2-Abi1復(fù)合體,導(dǎo)致細(xì)胞表面皺褶的減少、肌動蛋白聚合以及前端偽足的形成。TGF-β(轉(zhuǎn)化生長因子β)是致腎臟纖維化過程中重要的細(xì)胞因子,其主要是通過Smad依賴通路和非Smad依賴通路。TGF-β通過Rac1-NOXs-ROS通路激活核因子NF-κB,且Rac1對NF-κB轉(zhuǎn)錄因子依賴的啟動子起到正性調(diào)節(jié)的作用,增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄水平。Bakin等的研究指出,顯性負(fù)性突變體Rac1N17的表達(dá)阻礙TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞分裂原活化蛋白激酶p38與ATF2的級聯(lián)激活。TGF-β刺激人腎小管上皮細(xì)胞,Rac1、 ERK/MAPK激酶活化,Smad3銜接區(qū)磷酸化,collagen1的合成分泌增多。對于足細(xì)胞,Rac1活性增強(qiáng),會造成足突融合,產(chǎn)生大量蛋白尿。而Rac1抑制劑改善糖尿病引起的足細(xì)胞足突增寬和融合,上調(diào)裂隙膜骨架蛋白nephrin表達(dá)水平,表明Rac1可以調(diào)控nephrin,從而影響足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,進(jìn)一步參與DN的病理生理過程。Rac1激活配體獨(dú)立的異常鹽皮質(zhì)激素受體,與鹽敏感型高血壓及腎臟損傷密切相關(guān)�？傊�,Rac1通過協(xié)調(diào)多種信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)以及與特異的效應(yīng)物相互作用后,可以調(diào)控細(xì)胞骨架的重構(gòu),細(xì)胞之間的粘附,細(xì)胞的運(yùn)動、生長、凋亡以及一系列蛋白激酶的活化等生物學(xué)效應(yīng)。因此,明確ELMO1對Rac1作用的機(jī)制,有助于我們更加詳細(xì)的了解腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程,最終為腎臟疾病的預(yù)防和治療提出新的設(shè)想。 目前證實(shí),ELMO1與Dock180始終以復(fù)合物的形式存在。但是,在正常狀態(tài)下,兩者均通過自身內(nèi)在結(jié)構(gòu)域之間的相互作用而處于一種無活性狀態(tài)。在外界刺激下,ELMO1的自身抑制狀態(tài)先解除,進(jìn)而通過一系列反映解除Dock180的自身抑制,從而發(fā)揮活化Rac1的作用。由此可見,ELMO1的自身抑制結(jié)構(gòu)的釋放至關(guān)重要。ELMO的自身抑制結(jié)構(gòu)是由該蛋白分子N端抑制結(jié)構(gòu)域(EID)與C端的自動調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(EAD)相互結(jié)合構(gòu)成的。之后,學(xué)者發(fā)現(xiàn)在EID結(jié)構(gòu)域一側(cè)有RhoG結(jié)合活性,并證實(shí)了ELMO1與活化的RhoG能夠直接結(jié)合,介導(dǎo)ELMO1-Dock180復(fù)合物由胞漿向胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)、定位,并能促進(jìn)ELMO1釋放自身抑制,從而活化Rac1。廢除ELMO的RBD的GTP酶結(jié)合活性,則阻止了ELMO1-Dock180復(fù)合物向膜募集以及Rac信號傳導(dǎo)。隨著研究的進(jìn)展,又發(fā)現(xiàn)活化的RhoG能夠促進(jìn)ELMO1自身抑制部分釋放,但不足以自身抑制完全釋放,存在其他的信號通路。 另外,ELMO可以被Hck激酶磷酸化。Noriko Yokoyama等證實(shí)了能被Hck磷酸化的幾個ELMO1酪氨酸位點(diǎn)(18,216,511,395,720),若單點(diǎn)或者多點(diǎn)突變后,Rac1的活性均有下降,特別是ELMO1-4YF (Y18,216,511,395F)。同時發(fā)現(xiàn),4YF-Dock180的相互作用比起ELMO1WT-Dock180的相互作用并沒明顯改變改變。Hck能促進(jìn)ELMO1酪氨酸磷酸化,Rac1的活性上調(diào)。以上提示我們ELMO1酪氨酸磷酸化對Rac1的活性變化至關(guān)重要。然而,其改變是如何影響Rac1的活性,是否ELMO的磷酸化能引起自身抑制釋放,目前仍不清楚。 Nck-1包含了一個SH2和三個SH3結(jié)構(gòu)域,而SH2結(jié)構(gòu)域具有特異性識別酪氨酸殘基的磷酸化狀態(tài),從而使包含SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可以定位到其它蛋白的磷酸化酪氨酸位點(diǎn)上。這一過程構(gòu)成了信號穿過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞的基本事件,細(xì)胞外空間的信號被受體“感知”,繼而在胞內(nèi)空間轉(zhuǎn)化為另一種化學(xué)形式,如磷酸化的酪氨酸。酪氨酸的磷酸化狀態(tài)激活了串聯(lián)的蛋白-蛋白交互作用,其中包含SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)被召集到磷酸化酪氨酸位點(diǎn)上。這一過程激活了一系列最終導(dǎo)致基因表達(dá)改變等細(xì)胞響應(yīng)下游事件。 本研究選擇探討Nck-1-ELMO1-Rac1之間的相互作用,不僅可以從分子水平揭示蛋白質(zhì)的功能,而且對于提示細(xì)胞生長、發(fā)育、分化和凋亡以及理解生物調(diào)控機(jī)制等生命活動規(guī)律至關(guān)重要,為探討腎臟疾病的機(jī)理、疾病治療、疾病預(yù)防和新藥開發(fā)提供重要的理論基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)路線 1. Nck-1-ELMO1的相互作用 2. Nck-1-ELMO1的相互作用促進(jìn)ELMO1-Dock180復(fù)合物向胞膜募集并活化Rac1。 3. ELMO1-Nck-1的相互作用增強(qiáng)ELMO1與活化的RhoG之間的結(jié)合。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一、把Nck-1-SH2結(jié)構(gòu)域中的FLVRES保守序列里的精氨酸突變?yōu)橘嚢彼?構(gòu)建了SH2結(jié)構(gòu)域突變體質(zhì)粒,即R308K,其失去與磷酸化的酪氨酸結(jié)合的功能；另外把SH3結(jié)構(gòu)域中成對色氨酸色氨酸的第一個色氨酸突變?yōu)橘嚢彼?構(gòu)建了四個SH3結(jié)構(gòu)域突變體質(zhì)粒,即SH3-1-,2-(W38,143K), SH3-1-,3-(W38,229K), SH3-2-,3-(W143,229K), SH3-1-,2-,3-(W38,143,229K),相應(yīng)結(jié)構(gòu)域的功能基本消失。在293T細(xì)胞株中,共轉(zhuǎn)染ELMO1及Nck-1野生型或突變體質(zhì)粒,通過共免疫沉淀的方法,發(fā)現(xiàn)R308K-ELMO1的相互作用比ELMO1-Nck-1的相互作用明顯減弱,而上述Nck-1的其它突變體與ELMO1的相互作用沒有明顯改變。 二、以Nck-1(NCBI accession number BC006403) cDNA為模板,用PCR擴(kuò)增的方法,得到Nck-1-SH2, SH31, SH32和SH33片段后,克隆到pGEX-4T-3表達(dá)載體,構(gòu)建重組蛋白質(zhì)粒GST-Nck-1-SH2, SH31, SH32和SH33。在BL21大腸桿菌中誘導(dǎo)出各片段可溶性蛋白,制備GST融合蛋白小珠,同時在293T細(xì)胞株中,過表達(dá)ELMO1,通過GST Pull down實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)ELMO1主要與Nck-1SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合,而與SH3結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)合微弱。 三、構(gòu)建His-E1MO1體外重組蛋白質(zhì)粒。在BL21大腸桿菌中轉(zhuǎn)化,誘導(dǎo),表達(dá)出不溶性蛋白。接著對不溶性的His-E1MO1蛋白進(jìn)行變性純化,透析復(fù)性后,得到純化的His-E1MO1蛋白。最后,通過與GST或GST-Nck1-SH2融合蛋白的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)GST-Nck1-SH2與純化的His-ELMO1之間相互結(jié)合,而GST組沒有結(jié)合。 四、在293T細(xì)胞株中,共轉(zhuǎn)染ELMO1, Dock180, Nck-1或R308K后,通過Rac1活性實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ELMO1, Dock180, Nck-1的實(shí)驗(yàn)組比過表達(dá)ELMO1與Dock180的對照組,Rac1的活性明顯上調(diào)；而過表達(dá)ELMO1, Dock180與R308K的實(shí)驗(yàn)組,Rac1的活性沒有明顯改變。 五、干擾內(nèi)源性Nck-1, Rac1的活性明顯下降；在干擾內(nèi)源性Nck-1后轉(zhuǎn)染抗siRNA干擾的外源性Nck-1的重組質(zhì)粒后,Rac1的活性上調(diào)恢復(fù)；而轉(zhuǎn)染抗siRNA干擾的外源性R308K的重組質(zhì)粒后,Rac1的活性沒有恢復(fù)。 六、在293T細(xì)胞株中,單轉(zhuǎn)或共轉(zhuǎn)染ELMO1, Nck-1或R308K后,通過免疫熒光的方法,發(fā)現(xiàn)僅轉(zhuǎn)染ELMO1時,熒光定位在胞漿,而在共轉(zhuǎn)染Nck-1后,ELMO1紅色熒光在膜上可見,而在共轉(zhuǎn)R308K時,熒光仍只在胞漿可見。 七、以ELMO1為模板,用PCR擴(kuò)增的方法,得到ELMO1-495(1-495氨基酸片段相對應(yīng)的堿基序列),ELMO1-Δ531(532-727氨基酸片段相對應(yīng)的堿基序列)片段后,克隆到pcDNA3.1表達(dá)載體,成功地得到重組蛋白質(zhì)粒ELMO1-495, ELMO1-Δ531,其分別包含EID, EAD結(jié)構(gòu)域,兩者共同構(gòu)成ELMO1的一種“自我抑制”狀態(tài)。在293T細(xì)胞株中,共轉(zhuǎn)染ELMO1-495, ELMO1-Δ531或者Nck-1,通過分離胞漿與胞膜蛋白的實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ELMO1-495,ELMO1-Δ531及Nck-1的實(shí)驗(yàn)組比起過表達(dá)ELMO1-495及ELMO1-Δ531的對照組,ELMO1-495和ELMO1-Δ531的胞膜／胞漿的表達(dá)量明顯增加,而比起過表達(dá)ELMO1-495及Nck-1的對照組,ELMO1-495的胞膜／胞漿的表達(dá)量明顯下降。 八、把ELMO1-ARM1結(jié)構(gòu)域中第十二位的異亮氨基酸突變?yōu)榻z氨酸,第十六位的甘氨酸突變?yōu)楸彼?把ELMO1-ARM2結(jié)構(gòu)域中第七十二位的甘氨酸突變?yōu)楸彼?第七十七位的亮氨基酸突變?yōu)榻z氨酸,分別構(gòu)建了突變型質(zhì)粒ELMO1ARM1和ELMO1ARM2,兩者均會失去與活化型RhoG結(jié)合的功能。在293T細(xì)胞株中,轉(zhuǎn)染ELMO1W1, ELMO1ARM1或ELMO1ARM2結(jié)構(gòu)域突變體質(zhì)粒,通過與GST-Nck-1SH2融合蛋白的體外實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)比起ELMO1WT組,ELMO1ARM1或ELMO1ARM2與Nck-1-SH2的相互作用均沒有明顯改變。 九、把RhoG中第十二位的甘氨酸突變?yōu)槔i氨酸,構(gòu)建了活化型質(zhì)粒RhoGV12A,其翻譯的蛋白處于一種活化狀態(tài)。在293T細(xì)胞株中,共轉(zhuǎn)染ELMO1, RhoGV12A, Nck-1-WT, R308K或者SH3-1-,-2-,-3-(只保留SH2結(jié)構(gòu)域功能完整),通過共免疫沉淀的方法,發(fā)現(xiàn)與過表達(dá)ELMO1及RhoGV12A的對照組相比,過表達(dá)ELMO1,RhoGV12A和Nck-1的實(shí)驗(yàn)組或者過表達(dá)ELMO1,RhoGV12A和SH3-1-,-2-,-3-的實(shí)驗(yàn)組中,ELMO1-RhoGV12A的相互作用明顯加強(qiáng),而過表達(dá)ELMO1, RhoGV12A和R308K的實(shí)驗(yàn)組沒有明顯改變。 十、ELMO1-4YF(第18,216,395,511位點(diǎn)的酪氨酸突變?yōu)楸奖彼?其蛋白的酪氨酸磷酸化水平明顯減弱)與Nck-1之間基本不會結(jié)合,我們在293T細(xì)胞株中,共轉(zhuǎn)染RhoGV12A, ELMO1-WT或者4YF質(zhì)粒,通過共免疫沉淀的方法,發(fā)現(xiàn)與ELMO1-WT組相比,4YF-活化型RhoG的相互作用明顯下降。 結(jié)論 一、ELMO1與Nck-1-SH2結(jié)構(gòu)域直接相互作用。 二、Nck-1通過與ELMO1的相互作用促進(jìn)Rac1的活化。 三、ELMO1-Nck-1的相互作用促進(jìn)ELMO1-Dock180復(fù)合物向胞膜募集。 四、ELMO1-Nck-1的相互作用增強(qiáng)ELMO1與活化的RhoG之間的結(jié)合。
【圖文】：

（B)在293T細(xì)胞株中，共轉(zhuǎn)染ELMOl及Nck-1野生型或突變體質(zhì)粒，myc-抗體進(jìn)行共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，用flag-抗體檢測，R308K：與ELM01的結(jié)合明顯減少。為了進(jìn)一步證實(shí)ELM01與Nck-1 SH2結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，我們以Nck-1(NCBI accession number BC006403)cDNA 為模板，用 PCR 擴(kuò)增的方法，得到Nck-1-SH2, SH3', SH32和Sm^片段后，克隆到pGEX-4T-3表達(dá)載體，構(gòu)建重組蛋白質(zhì)粒 GST-Nck-1-SH2，SH3', SH32和 SH33 (圖 1.2A)。在 BL21 大

圖1.2 ELMOl主要與Nck-1 SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合Figure 1.2 ELMOl mainly interacts with Nck-1 SH2 domain(A) NCK-I SH2和SH3結(jié)構(gòu)域的體外重組蛋白質(zhì)粒圖示。（B)上述質(zhì)粒在BL21大腸桿菌內(nèi)表達(dá)，得到GST, GST-NCK-1 SH2和SH3結(jié)構(gòu)域的重組融合蛋1?，，與GST瓊脂糖珠子結(jié)合，得到GST, GST-SH2和SH3結(jié)構(gòu)域蛋白融合瓊脂糖珠子，考馬斯亮藍(lán)染膠檢測（第四條帶）。與ELM01進(jìn)行GST pull down實(shí)驗(yàn)，用myc-抗體檢測，ELM01主要與NCK-l SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合。為了證明ELM01與Nck-1 SH2結(jié)構(gòu)域之間是直接相互作用，構(gòu)建了His-ElMOl體外重組蛋白質(zhì)粒。在BL21大腸桿菌中轉(zhuǎn)化，IPTG誘導(dǎo)，在其體內(nèi)表達(dá)，取誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)后，上清，沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，發(fā)現(xiàn)His-ElMOl蛋白以不溶性的包涵體表達(dá)（圖1.3A)。接著對不溶性的His-ElMOl蛋白進(jìn)行變性純化，透析復(fù)性后，取40^1!純化的蛋白用抗E1M01的抗體檢測，得到His-ElMOl純化蛋白（圖1.3B)。最后，通過與GST或GST-Nckl-SH2融合蛋白的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)GST-Nck-1-SH2與純化的His-ELMOl之間相互結(jié)合，
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R692

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王筱霞;陳玉強(qiáng);汪年松;張棟梁;姚興梅;;Rac1抑制劑上調(diào)糖尿病小鼠腎小球nephrin的表達(dá)[J];中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志;2010年07期

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本文編號：2564741