【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)通過提取和體外培養(yǎng)SD大鼠的腎小管上皮細(xì)胞并建立氯化鎘染毒的細(xì)胞模型,檢測(cè)氯化鎘染毒24h后以及雷洛昔芬干預(yù)氯化鎘染毒24h后的SD大鼠腎小管上皮細(xì)胞的增殖情況,以及雷洛昔芬對(duì)氯化鎘誘導(dǎo)下腎小管上皮細(xì)胞損傷致1-α羥化酶的變化的干預(yù),為臨床上干預(yù)鎘中毒引起的骨質(zhì)疏松開辟新思路。方法:選取10只新生(出生不足24h)SD大鼠,SD大鼠腎小管上皮細(xì)胞原代的提取以及分離純化采用Percoll密度梯度離心法,用細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定法對(duì)所提取的腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。對(duì)于原代的培養(yǎng),培養(yǎng)液所含胎牛血清的濃度需高些(本研究所用濃度為15%);對(duì)于傳代細(xì)胞的培養(yǎng),本研究使用的的濃度為10%。本研究所包含的全部檢測(cè)方法均選取第3代腎小管上皮細(xì)胞。細(xì)胞相對(duì)生存率的檢測(cè)采用MTT法,應(yīng)用不同劑量(2.5、5、10、20、40μmol/L)的氯化鎘對(duì)腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行染毒,處理時(shí)間為24h;應(yīng)用不同劑量的雷洛昔芬(0.05、0.1、0.5、1μmol/L)以及固定劑量的氯化鎘(20μmol/L)共同處理細(xì)胞,處理時(shí)間為24h。將腎小管上皮細(xì)胞分為:A組(對(duì)照組):應(yīng)用不添加任何試劑的低糖培養(yǎng)基10ml處理細(xì)胞;B組(氯化鎘組):應(yīng)用含有20μmol/L氯化鎘的低糖培養(yǎng)液10ml處理細(xì)胞;C組(雷洛昔芬組):應(yīng)用含有20μmol/L氯化鎘以及0.1μmol/L雷洛昔芬的低糖培養(yǎng)液10ml處理細(xì)胞,處理時(shí)間為24h。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng):1.三組腎小管上皮細(xì)胞總RNA的提取:選取Trizol法;2.逆轉(zhuǎn)錄:選用天跟逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成c DNA;3.目的片段的擴(kuò)增:選用RT-PCR法;4.1-α羥化酶基因的表達(dá)水平的檢測(cè)。選取SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:未貼壁SD大鼠腎小管上皮原代細(xì)胞為球狀,培養(yǎng)2d后細(xì)胞完全貼壁,繼續(xù)培養(yǎng)4~5d左右細(xì)胞可長(zhǎng)滿10cm皿底,培養(yǎng)的傳代細(xì)胞呈多邊鵝卵石鋪路石狀;本研究RT-PCR結(jié)果:A組腎小管上皮細(xì)胞與培養(yǎng)皿底貼合緊密,細(xì)胞形態(tài)正常;B組腎小管上皮細(xì)胞與培養(yǎng)皿底貼合不緊密,大部分細(xì)胞形態(tài)異常,大量細(xì)胞死亡;C組與B組的腎小管上皮細(xì)胞相比,細(xì)胞與培養(yǎng)皿底貼合較為緊密,較少數(shù)細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變。MTT實(shí)驗(yàn)顯示:各鎘染毒組細(xì)胞增值情況與對(duì)照組相比明顯下降(P0.01),細(xì)胞增值情況與鎘濃度呈反比,20μmol/L Cd Cl2作用24h即可使腎小管上皮細(xì)胞增值情況由100.00%下降至51.82%;各雷洛昔芬干預(yù)組腎小管上皮細(xì)胞增值情況與鎘染毒組相比顯著升高(P0.01),0.1μmol/L RAL干預(yù)24h后可使腎小管細(xì)胞的增值情況升高至168.85%。RT-PCR研究顯示:B組1-α羥化酶基因的表達(dá)與A組相比顯著下降(P㩳0.01);C組腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)1-α羥化酶基因的表達(dá)與B組相比明顯增高(P0.05)。結(jié)論:氯化鎘對(duì)腎小管上皮細(xì)胞具有毒性損傷作用,損傷作用隨著劑量增高而增強(qiáng),雷洛昔芬對(duì)于氯化鎘染毒的腎小管上皮細(xì)胞具有干預(yù)作用,且不同劑量的雷洛昔芬干預(yù)效果不同。其機(jī)制可能是通過干預(yù)氯化鎘誘導(dǎo)下腎小管上皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致的1-α羥化酶基因的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷代謝,從而干預(yù)重金屬鎘中毒導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松,為臨床上應(yīng)用RAL治療重金屬鎘中毒導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R692

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本文編號(hào)：2560310