發(fā)布時間：2019-11-13 12:41

【摘要】：目的:本實驗通過提取和體外培養(yǎng)SD大鼠的腎小管上皮細胞并建立氯化鎘染毒的細胞模型,檢測氯化鎘染毒24h后以及雷洛昔芬干預氯化鎘染毒24h后的SD大鼠腎小管上皮細胞的增殖情況,以及雷洛昔芬對氯化鎘誘導下腎小管上皮細胞損傷致1-α羥化酶的變化的干預,為臨床上干預鎘中毒引起的骨質疏松開辟新思路。方法:選取10只新生(出生不足24h)SD大鼠,SD大鼠腎小管上皮細胞原代的提取以及分離純化采用Percoll密度梯度離心法,用細胞形態(tài)學鑒定法對所提取的腎小管上皮細胞進行鑒定。對于原代的培養(yǎng),培養(yǎng)液所含胎牛血清的濃度需高些(本研究所用濃度為15%);對于傳代細胞的培養(yǎng),本研究使用的的濃度為10%。本研究所包含的全部檢測方法均選取第3代腎小管上皮細胞。細胞相對生存率的檢測采用MTT法,應用不同劑量(2.5、5、10、20、40μmol/L)的氯化鎘對腎小管上皮細胞進行染毒,處理時間為24h;應用不同劑量的雷洛昔芬(0.05、0.1、0.5、1μmol/L)以及固定劑量的氯化鎘(20μmol/L)共同處理細胞,處理時間為24h。將腎小管上皮細胞分為:A組(對照組):應用不添加任何試劑的低糖培養(yǎng)基10ml處理細胞;B組(氯化鎘組):應用含有20μmol/L氯化鎘的低糖培養(yǎng)液10ml處理細胞;C組(雷洛昔芬組):應用含有20μmol/L氯化鎘以及0.1μmol/L雷洛昔芬的低糖培養(yǎng)液10ml處理細胞,處理時間為24h。逆轉錄-聚合酶鏈反應:1.三組腎小管上皮細胞總RNA的提取:選取Trizol法;2.逆轉錄:選用天跟逆轉錄試劑盒逆轉錄成c DNA;3.目的片段的擴增:選用RT-PCR法;4.1-α羥化酶基因的表達水平的檢測。選取SPSS18.0統(tǒng)計軟件對本研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。結果:未貼壁SD大鼠腎小管上皮原代細胞為球狀,培養(yǎng)2d后細胞完全貼壁,繼續(xù)培養(yǎng)4~5d左右細胞可長滿10cm皿底,培養(yǎng)的傳代細胞呈多邊鵝卵石鋪路石狀;本研究RT-PCR結果:A組腎小管上皮細胞與培養(yǎng)皿底貼合緊密,細胞形態(tài)正常;B組腎小管上皮細胞與培養(yǎng)皿底貼合不緊密,大部分細胞形態(tài)異常,大量細胞死亡;C組與B組的腎小管上皮細胞相比,細胞與培養(yǎng)皿底貼合較為緊密,較少數(shù)細胞發(fā)生形態(tài)改變。MTT實驗顯示:各鎘染毒組細胞增值情況與對照組相比明顯下降(P0.01),細胞增值情況與鎘濃度呈反比,20μmol/L Cd Cl2作用24h即可使腎小管上皮細胞增值情況由100.00%下降至51.82%;各雷洛昔芬干預組腎小管上皮細胞增值情況與鎘染毒組相比顯著升高(P0.01),0.1μmol/L RAL干預24h后可使腎小管細胞的增值情況升高至168.85%。RT-PCR研究顯示:B組1-α羥化酶基因的表達與A組相比顯著下降(P㩳0.01);C組腎小管上皮細胞內(nèi)1-α羥化酶基因的表達與B組相比明顯增高(P0.05)。結論:氯化鎘對腎小管上皮細胞具有毒性損傷作用,損傷作用隨著劑量增高而增強,雷洛昔芬對于氯化鎘染毒的腎小管上皮細胞具有干預作用,且不同劑量的雷洛昔芬干預效果不同。其機制可能是通過干預氯化鎘誘導下腎小管上皮細胞損傷導致的1-α羥化酶基因的表達,進而調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷代謝,從而干預重金屬鎘中毒導致的骨質疏松,為臨床上應用RAL治療重金屬鎘中毒導致的骨質疏松奠定基礎。
【學位授予單位】：桂林醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R692

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本文編號：2560310