【摘要】：研究背景 糖尿病(diabetes mellitus, DM)是由遺傳和環(huán)境因素相互作用引起的一組以糖代謝紊亂為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。隨著全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展、人口老年化和人民生活水平的改善,全球范圍內(nèi)DM患病率逐年上升,截止2010年DM患者達(dá)2.8億,預(yù)計(jì)2030年將達(dá)到4.3億。糖尿病已成為患病率、致殘率及死亡率僅次于腫瘤和心血管疾病的第三大慢性非傳染性疾病。糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是DM特異性微血管并發(fā)癥,也是DM患者常見的慢性并發(fā)癥之一。據(jù)統(tǒng)計(jì),30%-40%的1型糖尿病(type1diabetes,T1DM)患者有糖尿病腎損害,而2型糖尿病(type2diabetes,T2DM)患者中也約有20%發(fā)生DN。DN的特點(diǎn)之一是一旦出現(xiàn)腎功能損害,其進(jìn)展速度往往遠(yuǎn)快于非DN,乃至發(fā)展成終末期腎病(end stage renal disease,ESRD),需要進(jìn)行透析治療或腎移植。隨著DM患病率的增加,DN已成為歐美國家ESRD的首位原因,在我國ESRD的病因中也高居第2位。臨床觀察發(fā)現(xiàn),DN發(fā)展至ESRD時(shí),無論給予透析治療還是腎移植,患者的遠(yuǎn)期預(yù)后均比其它腎臟疾病患者差,這類患者常合并心血管并發(fā)癥,死亡率高。因此,DN已成為影響人類健康的一個(gè)重大問題。 DN的基本病理改變?yōu)槟I小球系膜細(xì)胞增殖和系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)增多、腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚和毛細(xì)血管通透性增高、足細(xì)胞損害和數(shù)量減少、腎小管肥大、腎小管基底膜增厚與分層,以及出入球小動(dòng)脈透明變性和動(dòng)脈硬化,伴隨蛋白尿的出現(xiàn),進(jìn)一步加劇腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化,最終進(jìn)展為ESRD。 DN的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜,至今尚未完全闡明。目前認(rèn)為DN是腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變、糖脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激、多種細(xì)胞因子、胰島素抵抗和遺傳因素共同作用的結(jié)果。在DN的發(fā)生發(fā)展過程中,腎小球血流動(dòng)力學(xué)改變、細(xì)胞增殖、細(xì)胞肥大等諸多方面,均有細(xì)胞因子的參與。種類繁多的細(xì)胞因子通過自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌途徑發(fā)揮作用,它們相互影響、相互制約,構(gòu)成了DN發(fā)病過程中復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò),在DN發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。 生長分化因子-15(GDF-15),是轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族成員的一個(gè)遠(yuǎn)支。GDF-15是由巨噬細(xì)胞在多種病理及環(huán)境應(yīng)激情況下活化表達(dá)的產(chǎn)物,巨噬細(xì)胞激活后通過分泌TNF-α上調(diào)GDF-15的表達(dá),而GDF-15負(fù)反饋抑制巨噬細(xì)胞活化產(chǎn)生TNF-α等細(xì)胞因子,故又稱巨噬細(xì)胞抑制因子-1(MIC-1),是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白,在體內(nèi)發(fā)揮廣泛的保護(hù)性調(diào)節(jié)作用。利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn),在糖尿病動(dòng)物模型腎損害的早期(7天),GDF-15作為其中主要的調(diào)節(jié)因子之一即有表達(dá)的明顯上調(diào)。另有基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),在1型和2型糖尿病動(dòng)物模型中,GDF-15基因敲除小鼠較野生型小鼠腎損害重。目前,GDF-15作為一種新型心血管保護(hù)因子,引起了人們的廣泛關(guān)注,GDF-15水平與多種心血管疾病(心力衰竭、急性冠脈綜合征及動(dòng)脈粥樣硬化)的診斷、危險(xiǎn)分層和預(yù)后判斷有密切關(guān)系。在T2DM中,患者血循環(huán)中GDF-15水平較健康對(duì)照者明顯升高。國外少量前瞻性研究發(fā)現(xiàn)：GDF-15不僅是1型糖尿病腎病患者全因死亡率及心血管疾病死亡率的良好預(yù)測指標(biāo),還能預(yù)測2型糖尿病患者尿蛋白增多的風(fēng)險(xiǎn)。但是,血漿GDF-15在2型糖尿病腎病不同臨床分期中的表達(dá)水平及其變化的臨床研究甚少。 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),是一種選擇性作用于內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子,在腎臟中主要是由足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞分泌。其生物學(xué)特性是增加血管通透性、促進(jìn)血管生成及增加黏附分子產(chǎn)生等。在生理情況下,足細(xì)胞分泌的少量VEGF具有維持內(nèi)皮窗孔的功能,適量的VEGF能保護(hù)和修復(fù)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞。高血糖、血管緊張素Ⅱ、TGF-β及晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)均能誘導(dǎo)足細(xì)胞過表達(dá)VEGF。過量的VEGF則可降低腎小球內(nèi)皮細(xì)胞電阻、增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性,導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生,促進(jìn)多種致纖維因子分泌、誘發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)沉積、腎小管基底膜增厚和腎間質(zhì)纖維化,促成腎小球硬化,從而在DN發(fā)病中發(fā)揮重要作用。動(dòng)物模型中阻斷VEGF可有效改善DN、減輕蛋白尿,而大量臨床研究表明DN患者血漿VEGF水平隨著腎病進(jìn)展有不同程度的提高。 內(nèi)皮抑素(ES),是VEGF的拮抗因子,兩者是目前抑制血管生成和促進(jìn)血管生成生物效應(yīng)最強(qiáng)的一對(duì)因子。ES可在多個(gè)環(huán)節(jié)抑制VEGF介導(dǎo)的促血管生成和促血管通透效應(yīng)。動(dòng)物模型中,糖尿病大鼠的血漿及腎組織中ES和VEGF表達(dá)增加,兩者的表達(dá)量均與糖尿病腎損害嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān),血漿中VEGF和ES也具有顯著正相關(guān)性。有文獻(xiàn)報(bào)道,慢性腎臟疾病患者、糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的血漿ES水平均較健康對(duì)照者明顯升高,但未見探討DN患者血漿ES水平變化的研究報(bào)道。且同時(shí)探討VEGF、ES這兩個(gè)細(xì)胞因子在2型糖尿病腎病患者體內(nèi)的表達(dá)水平、兩者與DN關(guān)系的臨床研究甚少。 研究目的 1.本研究第一部分應(yīng)用ELISA法,檢測血漿GDF-15在2型糖尿病腎病不同臨床分期中的表達(dá)水平及其變化,并分析GDF-15與尿微量白蛋白(mAlb)、估算的腎小球?yàn)V過率(eGFR)等反映糖尿病腎損害嚴(yán)重程度的臨床指標(biāo)之間的關(guān)系,旨在初步探討GDF-15在2型糖尿病腎病診斷、病情評(píng)估中的臨床應(yīng)用價(jià)值。 2.本研究第二部分應(yīng)用ELISA法,檢測血漿VEGF、ES在2型糖尿病腎病不同Mogensen分期中的表達(dá)水平及其變化,并分析兩者在DN不同臨床分期中的相互關(guān)系,旨在探討VEGF、ES與DN發(fā)生發(fā)展以及各臨床指標(biāo)之間的關(guān)系及其臨床意義。 具體研究內(nèi)容分為以下兩個(gè)部分： 第一章生長分化因子-15在2型糖尿病腎病患者血漿中的表達(dá)水平及其臨床意義 [目的] 探討生長分化因子-15在2型糖尿病腎病患者血漿中的表達(dá)水平及其臨床意義。 [方法] 1.研究對(duì)象 2型糖尿病及2型糖尿病腎病患者(自2013年6月至2013年9月,從南方醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科住院患者中收集)。 入選標(biāo)準(zhǔn) (1)30-75周歲； (2)符合1999年WHO (Word Health Organization,WHO)的2型糖尿病診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)； (3)受試者知情同意參加試驗(yàn)。 排除標(biāo)準(zhǔn)： (1)特殊類型的糖尿��； (2)近1個(gè)月內(nèi)發(fā)生糖尿病酮癥酸中毒、高滲性昏迷等急性并發(fā)癥； (3)近1月內(nèi)有腦梗塞或TIA病史者； (4)冠心病(ECG、臨床表現(xiàn)及病史)、急慢性心功能不全； (5)血ALT、AST大于等于正常值上限2倍； (6)發(fā)熱、急性感染及手術(shù)等應(yīng)激情況下患者； (7)有腫瘤病史者： (8)有泌尿系感染或糖尿病腎病以外腎臟疾病的患者； (9)已行透析治療或腎移植患者。 2.研究方法： 2.1根據(jù)Mogensen分期標(biāo)準(zhǔn),分為：(1)正常蛋白尿組(A組)30例,mAlb30mg/24h;(2)微量蛋白尿組(B組)20例,30mg/24h≤mAlb300mg/24h;(3)大量蛋白尿組(C組)30例,mAlb≥300mg/24h。各組在年齡、性別及體重指數(shù)(BMI)方面均匹配。 2.2根據(jù)患者年齡、性別和肌酐值,采用CKD-EPI公式計(jì)算腎小球?yàn)V過率,即估算的腎小球?yàn)V過率(estimated glomerular filtration rate, eGFR)。按eGFR≥90ml/min/1.73m2、60≤eGFR90ml/min/1.73m2、eGFR60ml/min/1.73m2將所有研究對(duì)象分為腎功能正常組(D組)、腎功能輕度受損組(E組)和慢性。腎功能不全組(F組)三個(gè)亞組,各組的樣本量分別為31、26和23,在年齡、性別及BMI方面均匹配。 2.3采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測各組患者血漿中GDF-15的濃度,并收集整理所有研究對(duì)象的臨床資料和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析： 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示。率的比較采用x2檢驗(yàn)；兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)；多組間資料比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis單因素方差分析。GDF-15與常見臨床指標(biāo)的相互關(guān)系采用偏相關(guān)分析。采用受試者工作特征(ROC)曲線,分析mAlb及GDF-15診斷腎功能受損(即eGFR90ml/min/1.73m2)的有效性。最后以mAlb為因變量、GDF-15及其它臨床指標(biāo)為自變量進(jìn)行多元線性回歸分析。P0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)果] 1.正常蛋白尿組和微量蛋白尿組的GDF-15水平分別為704.5(548.8-975.8)pg/ml、864.0(636.1-994.3) pg/ml,均低于大量蛋白尿組[1773.9(1099.1-2357.4)pg/ml](P均0.01)；正常蛋白尿組GDF-15水平低于微量蛋白尿組(P0.05)。 2.腎功能正常組和腎功能輕度受損組的GDF-15水平分別為752.2±340.9pg/ml、1399.5±1145.1pg/ml,均低于慢性腎功能不全組(2184.1±1673.8pg/ml)(P0.01,P0.05);腎功能正常組GDF-15水平低于腎功能輕度受損組(P0.01)。 3.偏相關(guān)分析顯示,血漿GDF-15與糖尿病病程、mAlb、尿素氮(BUN)及肌酐(sCr)呈顯著正相關(guān)(r=0.246,0.493,0.390,0.471,P均0.05),與eGFR及血漿白蛋白(Alb)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.438,-0.397,P均0.01)。 4.以mAlb為因變量進(jìn)行多元線性回歸分析,得到的回歸方程為mAlb=-2675.46+19.18SBP+0.49GDF_15,顯示：GDF-15與mAlb水平具有獨(dú)立相關(guān)性。 5.在對(duì)腎功能下降(eGFR90ml/min/1.73m2)的診斷中,GDF-15和mAlb的曲線下面積分別為0.801和0.717,GDF-15曲線下面積大于mAlb(P0.05)。當(dāng)733.78pg/ml作為GDF-15診斷腎功能受損的臨界值時(shí),敏感性和特異性達(dá)到最佳,分別為88.1%和58.1%。[結(jié)論] 1.GDF-15在2型糖尿病腎病患者血漿中的表達(dá)量隨著腎病進(jìn)展逐漸增多,與目前反映腎損害的經(jīng)典臨床指標(biāo)(mAlb、eGFR、BUN及sCr)存在顯著的相關(guān)性,且與mAlb水平獨(dú)立相關(guān),可反映腎病嚴(yán)重程度；GDF-15有望成為評(píng)估2型糖尿病腎病腎損害嚴(yán)重程度的一種新的血液學(xué)標(biāo)志物。 2.GDF-15濃度在腎功能輕度受損(eGFR90ml/min/1.73m2)時(shí)即有顯著性升高,且隨著eGFR的下降而逐漸升高；另外,在對(duì)腎功能下降(eGFR90ml/min/1.73m2)的診斷中,GDF-15曲線下面積大于mAlb;GDF-15有望成為早期診斷2型糖尿病腎病的一種新的血液學(xué)標(biāo)志物。 第二章血管內(nèi)皮生長因子和內(nèi)皮抑素與2型糖尿病腎病的關(guān)系研究 [目的] 探討血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和內(nèi)皮抑素(ES)與2型糖尿病腎病的關(guān)系。 [方法] 1.研究對(duì)象、入選標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)同第一章。 2.實(shí)驗(yàn)方法：根據(jù)Mogensen分期標(biāo)準(zhǔn),分為：(1)正常蛋白尿組(A組)30例,mAlb30mg/24h;(2)微量蛋白尿組(B組)20例,30mg/24h≤mAlb300mg/24h;(3)大量蛋白尿組(C組)30例,mAlb≥300mg/24h。各組在年齡、性別及BMI方面均匹配。采用ELISA法檢測各組患者血漿中VEGF和ES的表達(dá)水平,并收集整理所有研究對(duì)象的臨床資料和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。 3.統(tǒng)計(jì)方法：Spearman相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn),余同第一章。 [結(jié)果] 1.微量蛋白尿組和大量蛋白尿組的血漿VEGF水平分別為50.93(26.99-72.24)pg/ml、63.89(42.84-93.38)pg/ml,均高于正常蛋白尿組[45.96(24.94-64.37)pg/ml](P0.05,P0.01)；大量蛋白尿組VEGF水平高于微量蛋白尿組(P0.05)。 2.微量蛋白尿組和大量蛋白尿組的血漿ES水平分別為95.64(79.65-125.63)pg/ml、170.13(105.52-195.25)pg/ml,均高于正常蛋白尿組[86.67(76.69-119.02)pg/ml](P0.05,P0.01)；大量蛋白尿組的血漿ES水平高于微量蛋白尿組(P0.01)。 3.所有研究對(duì)象的血漿VEGF與SBP (r=0.226,P0.05)、糖尿病視網(wǎng)膜病變嚴(yán)重程度(r=0.221,P0.05)、mAlb (r=0.226,P0.01)、HDL(r=0.227,P0.05)呈顯著正相關(guān),與eGFR (r=-0.237,P0.05)及Alb (r=-0.233,P0.05)呈顯著負(fù)相關(guān)。 4.所有研究對(duì)象的血漿ES與糖尿病病程(r=0.252,P0.05)、糖尿病視網(wǎng)膜病變嚴(yán)重程度(r=0.229,P0.05)、SBP(r=0.312,P0.01)、BUN(r=0.459,P0.01)、 sCr (r=0.585,P0.01)、UA (r=0.320,P0.01)及mAlb (r=0.491,P0.01)呈顯著正相關(guān),與eGFR (r=-0.620,P0.01)及Alb (r=-0.432,P0.01)呈顯著負(fù)相關(guān)。 5.正常蛋白尿組和微量蛋白尿組血漿VEGF水平均與ES呈顯著正相關(guān)(r1=0.633, P10.01; r2=0.532, P20.05),而大量蛋白尿組血漿VEGF與ES不相關(guān)(r3=0.175,P30.05)。 [結(jié)論] 1.VEGF和ES在2型糖尿病腎病患者血漿中的表達(dá)量隨著腎病進(jìn)展逐漸增多,均與mAlb、eGFR存在顯著的相關(guān)性,兩者的聯(lián)合檢測可望成為評(píng)估DN嚴(yán)重程度的一種新的輔助手段。 2.血漿VEGF和ES在2型糖尿病腎病不同臨床分期中的相互關(guān)系發(fā)生變化,推測兩者的表達(dá)失衡可能促進(jìn)了DN的發(fā)生發(fā)展。
【圖文】：

不同eGFR水平的GDF-15濃度比較

圖2腎功能受損時(shí)GDF-15與mAlb的ROC曲線Fig.2 ROC of GDF-15 and mAlb in the state of renaldysfunction17
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R587.2;R692

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2555559