【摘要】：【背景】腎結(jié)石是梗阻性腎病常見(jiàn)原因之一,其發(fā)病率每年攀升。腎結(jié)石是微結(jié)晶集聚組成的,其中80%是草酸鈣。草酸鈣結(jié)晶腎小管上皮細(xì)胞損傷是腎結(jié)石的早期表現(xiàn),是同一疾病不同發(fā)展階段。因此研究腎結(jié)石靶定在早期階段有助于預(yù)防疾病的發(fā)生。結(jié)晶在腎小管的沉積會(huì)導(dǎo)致急性腎損傷,最終進(jìn)展為終末期腎病。伴隨腎功能下降的腎結(jié)石患者發(fā)生腎間質(zhì)纖維化,這一過(guò)程是多數(shù)腎臟疾病最終病理結(jié)果。大量研究表明腎間質(zhì)纖維化�？梢鹉I臟上皮細(xì)胞表型逐漸轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞表型,就是所謂上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)。文獻(xiàn)報(bào)道,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化可能與細(xì)胞增殖是相關(guān)的。例如:在體外,TGF-β1刺激小鼠腎小管上皮細(xì)胞抑制在G2/M期和產(chǎn)生能夠促使周細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞的促纖維化細(xì)胞因子。在體內(nèi)腎臟纖維化小鼠模型中,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化是纖維化損傷的啟動(dòng)因素,抑制細(xì)胞周期在G2期。長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)是近年來(lái)學(xué)者們爭(zhēng)相研究熱點(diǎn),它是非編碼RNAs的一種類型,長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸(Nucleotides,nt),幾乎沒(méi)有編碼蛋白質(zhì)能力。研究表明lncRNAs在生物學(xué)進(jìn)程中扮演重要角色,如調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡等。此外,人類很多疾病中發(fā)現(xiàn)lncRNAs表達(dá)異常并且參與疾病進(jìn)展,例如直腸癌,前列腺癌,腎癌,梗阻性腎病。目前,lncRNAs在腎結(jié)石領(lǐng)域研究甚少,而EMT是腎結(jié)石伴隨腎間質(zhì)纖維化關(guān)鍵啟動(dòng)因素之一。提出假設(shè)lncRNAs是通過(guò)調(diào)節(jié)EMT影響腎結(jié)石發(fā)生發(fā)展。本課題應(yīng)用lncRNAs和m RNAs芯片檢測(cè)正常小鼠腎組織和結(jié)晶組小鼠腎組織中l(wèi)ncRNAs和m RNAs表達(dá)譜差異。通過(guò)人鼠同源性對(duì)比,篩選出人的lncRNAs及其可能調(diào)控基因,并進(jìn)一步探討其在腎結(jié)石中作用和機(jī)制,為將來(lái)深入研究提供理論基礎(chǔ)�！灸康摹坷没蛐酒腿耸笸葱苑治龊Y選確定lncRNA-CHCHD4P4。探討CHCHD4P4在結(jié)晶腎損傷過(guò)程中的生物學(xué)功能和分子調(diào)控機(jī)制,為將來(lái)臨床防治腎結(jié)石提供分子靶點(diǎn)�！痉椒ā�1.用Agilent 8×60K小鼠全基因組芯片對(duì)3只結(jié)晶組和3只對(duì)照組小鼠腎組織進(jìn)行m RNAs和lncRNAs差異基因篩選,差異基因表達(dá)分析中采用Limma算法,篩選條件是Fold Change1.5,P0.05�；诓町恗 RNAs做了基因功能分析(GO)及信號(hào)通路分析(KEGG Pathway),得到顯著上調(diào)的GO-Term和顯著下調(diào)的GO-Term及其包含的基因,及顯著上調(diào)的Pathway和顯著下調(diào)的Pathway及其包含的基因。2.采用人鼠同源性序列比對(duì),獲得與鼠同源性人的lncRNAs。采用Real-time PCR(RT-PCR)技術(shù),在一水草酸鈣(COM)刺激人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)體外模型中驗(yàn)證CHCHD4P4表達(dá)水平。3.CHCHD4P4體外功能研究:選用HK-2細(xì)胞作為研究對(duì)象,轉(zhuǎn)染CHCHD4P4 Si RNA抑制CHCHD4P4表達(dá)水平或者轉(zhuǎn)染CHCHD4P4-pc DNA3.1過(guò)表達(dá)CHCHD4P4表達(dá)水平。體外分別用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR),免疫熒光,免疫印跡法檢測(cè)上皮間質(zhì)標(biāo)志物。對(duì)于細(xì)胞增殖和凋亡生物學(xué)行為采用CCK8,Edu,流式細(xì)胞儀等檢測(cè)�！窘Y(jié)果】1.微陣列芯片結(jié)果顯示差異表達(dá)lncRNAs共376條,其中結(jié)晶組表達(dá)上調(diào)154條,下調(diào)222條;差異表達(dá)m RNAs共2165條,上調(diào)1421條,下調(diào)744條。2.人鼠同源性篩選出15對(duì),RT-PCR驗(yàn)證獲得人源lncRNA是CHCHD4P4,鼠源lncRNA是AU015836,二者在結(jié)晶組模型中均高表達(dá)。3.在體外模型中,CHCHD4P4相對(duì)對(duì)照組高表達(dá)。結(jié)晶組上皮表型E-cadherin表達(dá)減少,而間質(zhì)表型vimentin,snail,ZEB1表達(dá)增加。同時(shí)結(jié)晶組細(xì)胞增殖能力減弱,凋亡水平增強(qiáng),而細(xì)胞周期基本沒(méi)有變化�！窘Y(jié)論】1.在體外,COM刺激HK-2細(xì)胞模型中發(fā)生EMT現(xiàn)象,與前期我們團(tuán)隊(duì)乙醛酸鹽誘導(dǎo)小鼠結(jié)晶腎損傷模型結(jié)果一致。2.結(jié)晶組相對(duì)對(duì)照組,CHCHD4P4高表達(dá)。CHCHD4P4 Si RNA可減弱上皮細(xì)胞表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變過(guò)程,而CHCHD4P4-pc DNA3.1可加快EMT發(fā)生。3.在結(jié)晶組,CHCHD4P4可抑制細(xì)胞增殖能力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,不改變細(xì)胞周期。4.在結(jié)晶腎損傷模型中,CHCHD4P4可能通過(guò)促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡。CHCHD4P4可能是腎結(jié)石發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中重要的調(diào)控分子。
【圖文】：

（一）成功構(gòu)建小鼠結(jié)晶腎損傷模型在顯微鏡下，CONTROL組沒(méi)有黑色鈣鹽沉積，而CAOX組小鼠皮髓交界處有黑色鈣鹽沉積（見(jiàn)圖1-1）。且半定量草酸鈣結(jié)晶評(píng)分顯示，CAOX組評(píng)分高于CONTROL組（見(jiàn)圖1-2）。以上結(jié)果表明小鼠結(jié)晶腎損傷模型構(gòu)建成功。圖1-1小鼠腎組織草酸鈣結(jié)晶沉積（50×）（CONTROL VS CAOX）圖1-2結(jié)晶組和對(duì)照組腎臟組織鈣鹽沉積評(píng)分注：***P<0.001

在顯微鏡下，，CONTROL組沒(méi)有黑色鈣鹽沉積，而CAOX組小鼠皮髓交界處有黑色鈣鹽沉積（見(jiàn)圖1-1）。且半定量草酸鈣結(jié)晶評(píng)分顯示，CAOX組評(píng)分高于CONTROL組（見(jiàn)圖1-2）。以上結(jié)果表明小鼠結(jié)晶腎損傷模型構(gòu)建成功。圖1-1小鼠腎組織草酸鈣結(jié)晶沉積（50×）（CONTROL VS CAOX）圖1-2結(jié)晶組和對(duì)照組腎臟組織鈣鹽沉積評(píng)分注：***P<0.001
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R692.4

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本文編號(hào)：2526500