發(fā)布時間：2019-07-17 08:39

【摘要】：研究背景：長鏈非編碼RNA (Long non-coding RNA, lncRNA;轉(zhuǎn)錄本長度200nt-10Kb)最初被認為是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物,并不具有任何生物學功能。但最近的研究表明,在多種腫瘤中都存在著lncRNA的異常表達,并且與腫瘤的生物學行為及預后密切相關(guān)。然而相對于目前篩查出的數(shù)萬條lncRNA而言,已經(jīng)鑒定出功能和作用機制的lncRNA僅占很小一部分。膀胱癌中l(wèi)ncRNA的表達情況及其可能的作用機制目前仍不清楚。目的：闡明膀胱癌中l(wèi)ncRNA的表達情況及其可能的作用機制。方法：1.選取膀胱尿路上皮癌及配對的癌旁組織5對,通過Array star公司的lncRNA芯片進行膀胱癌中l(wèi)ncRNA的表達譜研究。2.通過生物信息學分析篩選出差異表達的lncRNA和mRNA,并進行基因功能分析和信號通路分析,最后構(gòu)建基因共表達網(wǎng)絡。3.在差異表達最明顯的LncRNAs中隨機選擇4條(TNXA, CTA-134P22.2, CTC-276P9.1和KRT19P3),通過qRT-PCR在50對癌和癌旁組織中進行驗證。4.從篩選出的差異表達表達的lncRNA中選出LOC572558進行后續(xù)的功能實驗。我們首先構(gòu)建了過表達LOC572558的膀胱癌細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株,接下來通過CCK-8實驗檢測細胞增殖,流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡,劃痕實驗和Transwell實驗檢測遷移和侵襲,來探討過表達LOC572558對膀胱癌細胞生物學行為的影響。5.通過磷酸化蛋白芯片和western-blot檢測并驗證過表達LOC572558后多條信號通路中蛋白磷酸化水平的變化,并通過生物信息學分析總結(jié)LOC572558是通過哪些信號通路中的關(guān)鍵蛋白發(fā)揮其調(diào)控作用的。結(jié)果：1.我們發(fā)現(xiàn)了3324條差異表達的LncRNA(在癌和癌旁組織差異表達2倍以上),其中明顯表達差異的LncRNA為110條(差異表達8倍以上),包括88條表達下調(diào)和22條表達上調(diào)的LncRNA。2.通過生物信息學分析我們發(fā)現(xiàn)這些異常表達的LncRNA可能與膀胱癌的發(fā)生和進展有關(guān),其功能可能是通過調(diào)控P53、細胞周期或者PPAR信號通路中的蛋白而實現(xiàn)的。3.過表達LOC572558可以抑制膀胱癌細胞的增殖,誘導發(fā)生晚期凋亡為主的凋亡,抑制膀胱癌細胞的侵襲和遷移,并使細胞周期阻滯于S期。4.以15%為cutoff值,我們通過蛋白磷酸化芯片發(fā)現(xiàn)過表達LOC572558可以上調(diào)38個蛋白以及下調(diào)61個的蛋白磷酸化水平。生物信息學分析和Western-blot驗證表明p53和CREB是LOC572558發(fā)揮調(diào)控作用的關(guān)鍵基因。結(jié)論：膀胱癌中存在廣泛的lncRNA的異常表達,可能與膀胱癌的發(fā)生及進展相關(guān)。在膀胱癌中,LOC572558通過上調(diào)p53及下調(diào)CREB發(fā)揮抑癌基因的作用。它可能成為未來膀胱癌治療的靶點之一。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.14

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本文編號：2515378