發(fā)布時(shí)間：2019-07-17 08:39

【摘要】：研究背景：長(zhǎng)鏈非編碼RNA (Long non-coding RNA, lncRNA;轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度200nt-10Kb)最初被認(rèn)為是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物,并不具有任何生物學(xué)功能。但最近的研究表明,在多種腫瘤中都存在著lncRNA的異常表達(dá),并且與腫瘤的生物學(xué)行為及預(yù)后密切相關(guān)。然而相對(duì)于目前篩查出的數(shù)萬(wàn)條lncRNA而言,已經(jīng)鑒定出功能和作用機(jī)制的lncRNA僅占很小一部分。膀胱癌中l(wèi)ncRNA的表達(dá)情況及其可能的作用機(jī)制目前仍不清楚。目的：闡明膀胱癌中l(wèi)ncRNA的表達(dá)情況及其可能的作用機(jī)制。方法：1.選取膀胱尿路上皮癌及配對(duì)的癌旁組織5對(duì),通過(guò)Array star公司的lncRNA芯片進(jìn)行膀胱癌中l(wèi)ncRNA的表達(dá)譜研究。2.通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選出差異表達(dá)的lncRNA和mRNA,并進(jìn)行基因功能分析和信號(hào)通路分析,最后構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。3.在差異表達(dá)最明顯的LncRNAs中隨機(jī)選擇4條(TNXA, CTA-134P22.2, CTC-276P9.1和KRT19P3),通過(guò)qRT-PCR在50對(duì)癌和癌旁組織中進(jìn)行驗(yàn)證。4.從篩選出的差異表達(dá)表達(dá)的lncRNA中選出LOC572558進(jìn)行后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)。我們首先構(gòu)建了過(guò)表達(dá)LOC572558的膀胱癌細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株,接下來(lái)通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡,劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移和侵襲,來(lái)探討過(guò)表達(dá)LOC572558對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。5.通過(guò)磷酸化蛋白芯片和western-blot檢測(cè)并驗(yàn)證過(guò)表達(dá)LOC572558后多條信號(hào)通路中蛋白磷酸化水平的變化,并通過(guò)生物信息學(xué)分析總結(jié)LOC572558是通過(guò)哪些信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白發(fā)揮其調(diào)控作用的。結(jié)果：1.我們發(fā)現(xiàn)了3324條差異表達(dá)的LncRNA(在癌和癌旁組織差異表達(dá)2倍以上),其中明顯表達(dá)差異的LncRNA為110條(差異表達(dá)8倍以上),包括88條表達(dá)下調(diào)和22條表達(dá)上調(diào)的LncRNA。2.通過(guò)生物信息學(xué)分析我們發(fā)現(xiàn)這些異常表達(dá)的LncRNA可能與膀胱癌的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān),其功能可能是通過(guò)調(diào)控P53、細(xì)胞周期或者PPAR信號(hào)通路中的蛋白而實(shí)現(xiàn)的。3.過(guò)表達(dá)LOC572558可以抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)發(fā)生晚期凋亡為主的凋亡,抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲和遷移,并使細(xì)胞周期阻滯于S期。4.以15%為cutoff值,我們通過(guò)蛋白磷酸化芯片發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)LOC572558可以上調(diào)38個(gè)蛋白以及下調(diào)61個(gè)的蛋白磷酸化水平。生物信息學(xué)分析和Western-blot驗(yàn)證表明p53和CREB是LOC572558發(fā)揮調(diào)控作用的關(guān)鍵基因。結(jié)論：膀胱癌中存在廣泛的lncRNA的異常表達(dá),可能與膀胱癌的發(fā)生及進(jìn)展相關(guān)。在膀胱癌中,LOC572558通過(guò)上調(diào)p53及下調(diào)CREB發(fā)揮抑癌基因的作用。它可能成為未來(lái)膀胱癌治療的靶點(diǎn)之一。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.14

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本文編號(hào)：2515378