【摘要】：腎小管間質(zhì)纖維化以腎小管萎縮、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)積聚和腎間質(zhì)慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)纖維化為特征,是各種原因?qū)е碌穆阅I臟病的共同病理生理過程。其發(fā)生發(fā)展包括多個(gè)環(huán)節(jié),如：抑制與促進(jìn)纖維化細(xì)胞因子失衡、氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)、炎癥反應(yīng)、腎臟固有細(xì)胞及免疫細(xì)胞凋亡等。腎小管間質(zhì)纖維化程度與腎功能進(jìn)行性下降相關(guān),并且與疾病的預(yù)后密切相關(guān)。在此過程中,腎臟組織呈不可逆的損傷,并伴隨腎臟功能的逐漸下降,逐步發(fā)展至終末期腎病。 腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)是導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化的重要因素。腎小管上皮細(xì)胞是一種極性細(xì)胞,其極性主要是由表皮黏附分子E-鈣粘蛋白(E-cadherin)等細(xì)胞間緊密連接成分以及細(xì)胞與基底膜的粘附作用來(lái)維持的。多種修飾后蛋白,如脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物、晚期糖基化產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGES)等可激活腎小管上皮細(xì)胞,增加TGF-β等致纖維化生長(zhǎng)因的表達(dá),誘導(dǎo)ECM大量合成、分泌,導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。2002年,Iwano等學(xué)者成功建立單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteric obstruction, UUO)小鼠模型,該小鼠腎小管上皮細(xì)胞能特異性表達(dá)LacZ,通過LacZ基因表達(dá)示蹤細(xì)胞的來(lái)源,發(fā)現(xiàn)約36%的間質(zhì)成纖維細(xì)胞由被激活的腎小管上皮細(xì)胞EMT而成,轉(zhuǎn)分化后的腎小管上皮細(xì)胞獲得分泌ECM的功能,合成、分泌ECM增多,但降解減少,ECM數(shù)量明顯增多,最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。腎小管上皮細(xì)胞EMT的基本步驟包括：分化成熟的腎小管上皮細(xì)胞失去自身極性,E-cadherin表達(dá)下調(diào)或消失,細(xì)胞間緊密連接被破壞,失去原有上皮細(xì)胞表型,上皮細(xì)胞黏附特性喪失,腎小管上皮細(xì)胞遷移能力增強(qiáng),從基底膜上脫落,胞漿內(nèi)細(xì)胞骨架重新排列,轉(zhuǎn)而表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞表型,如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-smooth muscle actin, α-SMA)、上皮型的角蛋白(cytokeratin,CK)、波形纖維蛋白(Vimentin, Vim)等。肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast)等腎間質(zhì)細(xì)胞能合成和分泌ECM,其數(shù)量的多少被認(rèn)為與腎功能進(jìn)行性惡化相關(guān),并且可作為預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的指標(biāo)之一。 晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidation protein products, AOPP)是一種新型尿毒毒素,其水平在CKD患者體內(nèi)增高,并且隨著腎功能的惡化而呈持續(xù)升高趨勢(shì)。AOPP是氧化系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生氧化損傷所形成的交聯(lián)產(chǎn)物,主要成分是被氧化的血清白蛋白,含有雙酪氨酸及羰基官能團(tuán),與AGES的結(jié)構(gòu)相似。大量研究結(jié)果表明AOPP是氧化應(yīng)激的產(chǎn)物,具有氧化應(yīng)激活性,通過引起氧化應(yīng)激,能導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂,促使多種疾病的發(fā)生發(fā)展。同時(shí),AOPP也是一種促炎癥反應(yīng)介質(zhì),可以通過單核-巨噬細(xì)胞等吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā),介導(dǎo)炎癥因子大量合成、釋放,形成級(jí)聯(lián)放大炎癥反應(yīng),損傷血管內(nèi)皮,是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。在體外研究中,AOPP能誘導(dǎo)足細(xì)胞表型改變,失去E-cadherin等上皮細(xì)胞表型特征,下調(diào)足細(xì)胞特征蛋白nephrin、podocy表達(dá),上調(diào)α-SMA等間質(zhì)細(xì)胞表型特征表達(dá),引起蛋白尿；誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)及胰島素抵抗,引起代謝綜合征。 氧化應(yīng)激(Oxidative stress, OS)是細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化能力的失衡,與多種疾病關(guān)系密切。其中,活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)的增多、NADPH氧化酶的活化在氧化應(yīng)激引起細(xì)胞組織氧化損傷過程中發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí),一方面,導(dǎo)致細(xì)胞和分子的功能紊亂,氧化產(chǎn)物不能被抗氧化系統(tǒng)及時(shí)清除,產(chǎn)生的大量ROS蓄積在細(xì)胞內(nèi)；導(dǎo)致抗氧化酶的非酶糖基化增多,細(xì)胞抗氧化酶活性降低,使得機(jī)體的抗氧化能力下降；另一方面,氧化應(yīng)激時(shí),NADPH氧化酶被活化,細(xì)胞膜受損傷后,引起細(xì)胞膜液態(tài)流動(dòng)性和脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷,生物膜的脂質(zhì)過氧化,細(xì)胞內(nèi)蛋白和酶變性,造成DNA損傷。此外,蓄積的ROS能促使脂質(zhì)過氧化,蛋白質(zhì)硝基化,脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化產(chǎn)物與受體結(jié)合,介導(dǎo)新的氧化應(yīng)激反應(yīng),造成惡性循環(huán)。同時(shí),ROS作為第二信使激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)途徑和轉(zhuǎn)錄因子,導(dǎo)致核因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB)激活,進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激狀態(tài)。增多的ROS激活Src酶,使得維持細(xì)胞極性的鈣黏蛋白所連接的p120-catenin酪氨酸磷酸化作用增強(qiáng)并移位,隨后通過Rho/Rho通路破壞細(xì)胞間連接。 ROS來(lái)源廣泛,多種酶系統(tǒng)均可合成,其中主要包括NADPH氧化酶系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn),蛋白尿、高糖條件等多種因素均可誘發(fā)氧化應(yīng)激,激活腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的NADPH氧化酶系統(tǒng),以NADH作為底物,NADHP提供電子,產(chǎn)生O2-,通過激活PKC、己糖胺、多元醇、AGEs等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,活化腎小管上皮細(xì)胞,從而導(dǎo)致ROS合成、分泌增多；大量的ROS產(chǎn)生、蓄積,調(diào)節(jié)PKC、絲裂原活化蛋白激酶和各種細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),導(dǎo)致ECM基因表達(dá)上調(diào)；同時(shí),激活的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)進(jìn)一步加重ROS誘導(dǎo)的腎損傷。另?yè)?jù)研究表明,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growing factor-β1.TGF-β1)等致纖維化因子刺激大鼠腎小管上皮細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加,同時(shí)NADPH氧化酶亞單位表達(dá)顯著上調(diào),而給予NADPH氧化酶抑制劑DPI則能阻斷這種現(xiàn)象。 ROS半衰期極短,體外檢測(cè)困難。但是,丙二醛(MDA)這種氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生脂質(zhì)代謝物,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,體外檢測(cè)方便,可以作為評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激的良好指標(biāo)。此外,此外抗氧化酶超氧化氧歧化酶(SOD)活力、過氧化氫酶(CAT)活力、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)活力也能較好地評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激的抗氧化能力。 在本實(shí)驗(yàn)中,利用次氯酸氧化BSA制備AOPP,以人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞株)作為靶細(xì)胞,給予不同濃度AOPP刺激,通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,觀察細(xì)胞表型蛋白α-SMA、E-cadherin及其對(duì)應(yīng)mRNA表達(dá)的變化,并檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)(MDA含量、SOD活力、CAT活力及GSH-px活力)的變化；并觀察使用NADHP氧化酶抑制劑DPI、氧自由基清除劑C-SOD預(yù)處理后,AOPP誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激、EMT的變化情況,從而探討AOPP對(duì)腎小管上皮細(xì)胞EMT的影響及作用機(jī)制,為進(jìn)一步抑制腎小管上皮細(xì)胞EMT、防治腎間質(zhì)纖維化提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 一、研究目的 觀察人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞株)在AOPP刺激后,表型蛋白α-SMA.E-cadherin及其對(duì)應(yīng)mRNA的變化、氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化；觀察使用NADHP氧化酶抑制劑DPI、氧自由基清除劑C-SOD預(yù)處理后,AOPP誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激、EMT的變化情況。 二、研究方法 1、AOPP的制備 按1：140的摩爾比例,將無(wú)內(nèi)毒素牛血清白蛋白(BSA)與次氯酸混合,室溫下放置30min,加入PBS透析24h去除殘留的次氯酸,所得樣品用Detoxi-Gel凝膠柱去除內(nèi)毒素。AOPP含量根據(jù)分光光度計(jì)0D340測(cè)定。 2、人近端腎小管上皮細(xì)胞株HK-2的培養(yǎng) HK-2細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中孵育(37℃、5%C02)。觀察細(xì)胞長(zhǎng)至80%以上融合時(shí),胰酶消化后接種至6孔培養(yǎng)板繼續(xù)傳代培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)至約70%-80%時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 3、AOPP對(duì)HK-2細(xì)胞α-SMA.E-cadherin表達(dá)的劑量依賴效應(yīng) 給予不同濃度AOPP(50、100、200、400μg/ml)與細(xì)胞共同孵育24h,50μg/ml BSA作為陰性對(duì)照組。收集細(xì)胞樣本,分別采用Western blot和Real Time Quantitative PCR(RT-qPCR)檢測(cè)α-SMA.E-cadherin的蛋白和mRNA表達(dá)量。 4、AOPP對(duì)HK-2細(xì)胞α-SMA、E-Cadherin表達(dá)的時(shí)間依賴效應(yīng) 以200μg/ml AOPP、50μ g/ml BSA與細(xì)胞分別孵育不同時(shí)間(30min、1h、3h、6h、12h、24h),收集細(xì)胞樣本,分別采用Western blot和RT-qPCR檢測(cè)α-SMA.E-cadherin的蛋白和mRNA表達(dá). 5、AOPP及抑制劑預(yù)處理對(duì)HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 分別用200μg/ml AOPP、50μ g/ml BSA以及以100μ mol/L DPI或200U/m1C-SOD預(yù)處理1h后再加入200μ g/ml AOPP刺激細(xì)胞。分別孵育30min、1h、24h后收集細(xì)胞樣本,制作成細(xì)胞勻漿,按各試劑盒所示方法測(cè)定并根據(jù)公式計(jì)算出丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、過氧化氫酶(CAT)活力、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH—px)活力；24h后收集各組細(xì)胞樣本采用Western blot和RT-qPCR檢測(cè)α-SMA、E-cadherin的蛋白和mRNA表達(dá)量。 三、結(jié)果 1、AOPP對(duì)HK-2細(xì)胞α-SMA、E-cadherin表達(dá)的劑量依賴效應(yīng) 與空白對(duì)照組及BSA組相比,不同濃度AOPP與細(xì)胞共培育可顯著上調(diào)α-SMA蛋白表達(dá),下調(diào)E-cadherin表達(dá),并且在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴效應(yīng)。 2、AOPP對(duì)HK-2細(xì)胞α-SMA、E-cadherin表達(dá)的時(shí)間依賴效應(yīng) 與空白對(duì)照組及BSA組相比,200μg/ml AOPP刺激細(xì)胞30min即可引起E-cadherin蛋白和mRNA表達(dá)下調(diào),12h后E-cadherin表達(dá)顯著減少；6h后可見α-SMA蛋白表達(dá)上調(diào),12h后α-SMA mRNA表達(dá)上調(diào),說明AOPP對(duì)HK-2細(xì)胞α-SMA、E-cadherin表達(dá)呈時(shí)間依賴效應(yīng)。 3、AOPP及抑制劑對(duì)HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與空白對(duì)照組及BSA組相比,200μ g/m1AOPP刺激HK-2細(xì)胞早期即可引起MDA含量上升,SOD活力、CAT活力及GSH-px活力下降。給予NADPH氧化酶抑制劑DPI、氧自由基清除劑C-SOD能部分抑制AOPP誘導(dǎo)的細(xì)胞a-SMA表達(dá)上調(diào)、E-cadherin表達(dá)下調(diào),降低MDA含量,提高SOD活力、CAT活力及GSH-px活力。四、結(jié)論 AOPP通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)人近端腎小管上皮細(xì)胞EMT,并且存在劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)；抑制NADPH氧化酶活性及增加氧自由基清除可以部分抑制腎小管上皮細(xì)胞EMT,從而延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R692

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2495380