發(fā)布時(shí)間：2019-05-24 20:24

【摘要】：研究背景 膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì),嚴(yán)重威脅人類健康。根據(jù)其浸潤深度,主要分為淺表性膀胱癌及浸潤性膀胱癌,其中尿路上皮癌約占90%[1]。膀胱腫瘤的治療手段仍然采用手術(shù)為主放化療為輔的治療方案,但其療效仍不確定,診斷為浸潤性BCa患者術(shù)后2年內(nèi)約有50%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,5年生存率僅有27%-50%,因發(fā)生轉(zhuǎn)移而未能及時(shí)手術(shù)切除,其中位生存期為7-20個(gè)月[2]。膀胱癌的早期診斷及術(shù)后復(fù)發(fā)成為影響治愈率及改善患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵因素。目前,評(píng)估膀胱癌患者腫瘤進(jìn)展及預(yù)后主要是根據(jù)術(shù)后病理分級(jí)及臨床分期[3]。然而,由于在相同病理分級(jí)及臨床分期的膀胱癌患者中,呈現(xiàn)多樣化的臨床預(yù)后。這可能與腫瘤相關(guān)基因表達(dá)差異相關(guān),而膀胱癌分子生物學(xué)的發(fā)展及靶向基因的發(fā)現(xiàn)將為膀胱癌提供新的治療策略。通過對(duì)人體的遺傳物質(zhì)進(jìn)行修正、補(bǔ)充或改造,即可達(dá)到治療疾病的目的,即“基因治療”(gene therapy)。隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的進(jìn)展以及基因的發(fā)現(xiàn),人類基因治療已成為現(xiàn)實(shí)。在膀胱腫瘤基因治療的研究上,人們也取得了許多重要的成果。近年來,線粒體蛋白質(zhì)翻譯延伸因子Tu(mitochondrial Tu translation elongation factor, TUFM)在腫瘤發(fā)生進(jìn)展中的作用及機(jī)制逐漸成為研究熱點(diǎn)。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,發(fā)現(xiàn)TUFM基因在人膀胱癌[4]、胃癌[5]、胰腺癌[6-7]、結(jié)直腸癌[8]、食管鱗狀細(xì)胞癌[9]、卵巢癌[10]等腫瘤細(xì)胞株或組織中呈高表達(dá),其中TUFM的表達(dá)水平與胃癌及結(jié)直腸癌的臨床分期和預(yù)后相關(guān)。TUFM蛋白在胃腺癌組織中不表達(dá)或低表達(dá)的患者臨床分期一般較高,術(shù)后生存率較低,預(yù)后較差[8]；而結(jié)直腸癌組織中TUFM高表達(dá)的患者進(jìn)展較快,5年內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)率較高[9],提示在TUFM在不同腫瘤中表達(dá)不同,從而得出了不同的結(jié)論。盡管相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)TUFM蛋白在大部分腫瘤中呈高表達(dá),并與胃癌和結(jié)直腸癌臨床預(yù)后相關(guān),但其在腫瘤發(fā)生進(jìn)展中的作用機(jī)制及該蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響仍不清楚。而且,TUFM在膀胱癌中的表達(dá)及其對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)功能特性的影響并不清楚。本研究首次探討TUFM基因在膀胱癌中的表達(dá),成功建立TUFM低表達(dá)細(xì)胞系,之后通過相關(guān)方法檢測(cè),進(jìn)一步研究了沉默TUFM基因后對(duì)膀胱癌細(xì)胞株生物特性的影響。 研究目的 探討TUFM基因在膀胱癌組織及細(xì)胞中的表達(dá),探討靶向沉默TUFM基因后對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞生物功能的影響。 方法 本研究分為兩部分： 一、檢測(cè)TUFM基因在膀胱癌組織及細(xì)胞中的表達(dá) 1. TUFM基因在膀胱癌患者組織標(biāo)本中的表達(dá)檢測(cè) 膀胱癌及其配對(duì)癌旁正常組織來自在南方醫(yī)院泌尿外科住院行TURBT或膀胱癌根治術(shù)的患者,經(jīng)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),獲得患者知情同意。取得的膀胱上皮粘膜組織標(biāo)本經(jīng)南方醫(yī)院病理科鑒定證實(shí)為膀胱尿路上皮癌組織,然后小組織放入凍存管,放入液氮后,-80℃冰箱保存?zhèn)溆�。根�?jù)病理診斷分為浸潤性尿路上皮癌組、高級(jí)別非浸潤性尿路上皮癌組、低級(jí)別非浸潤性尿路上皮癌組和癌旁組織組,應(yīng)用免疫組化和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)27例膀胱癌及癌旁組織中TUFM的表達(dá)水平,研究其與病理分級(jí)、臨床分期之間的相關(guān)性。 2. TUFM基因在膀胱癌細(xì)胞及膀胱上皮永生化細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè) 收集兩株人源膀胱癌細(xì)胞(T24、UMUC-3)和膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1,用TRIzol提取總RNA,去DNA,逆轉(zhuǎn)錄,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)三株細(xì)胞中TUFM的表達(dá)水平,比較兩株人源膀胱癌細(xì)胞與膀胱上皮永生化細(xì)胞的表達(dá)差異,并據(jù)此選取細(xì)胞株進(jìn)一步研究。 二、沉默TUFM基因后對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞生物功能影響的檢測(cè) 1.TUFM基因低表達(dá)細(xì)胞系的建立及轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)。 選取對(duì)數(shù)生長期的T24細(xì)胞株分為三組,分別為干擾組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組,其中干擾組用RNAi的方法,應(yīng)用脂質(zhì)體Lipo2000,將特異性siRNA干擾片段轉(zhuǎn)入細(xì)胞,沉默膀胱癌T24細(xì)胞TUFM基因的表達(dá)；陰性對(duì)照組細(xì)胞用相同方法轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照片段；空白對(duì)照組則不作任何處理。48小時(shí)后用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)干擾及陰性對(duì)照組干擾片段的轉(zhuǎn)染效率。 2.沉默TUFM基因后對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖、遷移、凋亡及細(xì)胞周期的檢測(cè)。 MTT法檢測(cè)T24細(xì)胞的增殖。應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞的抑制率,繪制細(xì)胞生長曲線,評(píng)價(jià)沉默TUFM基因后對(duì)T24細(xì)胞增殖能力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwe11遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力,評(píng)價(jià)沉默TUFM基因后對(duì)T24細(xì)胞遷移能力的影響。選用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)和DeadEnd TM比色法凋亡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后T24細(xì)胞的凋亡。流式檢測(cè)儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后T24細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果 第一部分 1.共收集膀胱癌組織標(biāo)本27例,浸潤性尿路上皮癌組7例、高級(jí)別非浸潤性尿路上皮癌組7例、低級(jí)別非浸潤性尿路上皮癌組13例和癌旁組織組9例。全部標(biāo)本均經(jīng)南方醫(yī)院病理科證實(shí)為膀胱尿路上皮癌,其中男性19例,女性8例,年齡32-81歲,中位年齡64歲。臨床病理分期按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)中TNM標(biāo)準(zhǔn)：≤T1期：20例,T1期：7例。免疫組化的結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,膀胱癌組織中TUFM高表達(dá),呈胞漿染色;TUFM的表達(dá)浸潤性尿路上皮癌組高于非浸潤性尿路上皮癌組,而且,高級(jí)別尿路上皮癌組高于低級(jí)別尿路上皮癌。熒光定量PCR結(jié)果顯示組織中TUFM的mRNA水平隨著膀胱癌組織的病理分級(jí)升高而升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其中浸潤性尿路上皮癌表達(dá)最高,癌旁組織組表達(dá)最低。 2.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,兩株人源浸潤性膀胱尿路上皮癌細(xì)胞株(T24、UMUC3)中TUFM基因表達(dá)明顯高于膀胱上皮永生化細(xì)胞(SV-HUC-1),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其中T24細(xì)胞的TUFM基因表達(dá)量最高。 第二部分 1.由于T24細(xì)胞的TUFM基因表達(dá)最高,我們選取T24細(xì)胞來研究TUFM基因?qū)?xì)胞生物特性的影響。選取對(duì)數(shù)生長期的T24細(xì)胞株分為三組,分別為干擾組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組,應(yīng)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,將50umo1/L的特異性siRNA轉(zhuǎn)染入T24細(xì)胞,48小時(shí)后,分別用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)干擾及陰性對(duì)照組干擾片段的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示：干擾組(si-TUFM組)的TUFM表達(dá)明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組之間的TUFM表達(dá)比較無顯著差異,提示我們已經(jīng)成功建立TUFM低表達(dá)膀胱癌細(xì)胞系 2.MTT法檢測(cè)T24細(xì)胞的增殖能力結(jié)果顯示,干擾組細(xì)胞增殖抑制率隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間增加而增高,在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h、96h,細(xì)胞增殖抑制率波動(dòng)在9.5%±1.4%到22.7%±1.2%的范圍。將50nmol/L的siRNA-TUFM和siRNA-NC干擾48小時(shí)后T24細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在0、12和24小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察三組細(xì)胞向中線遷移的距離及細(xì)胞數(shù),觀察TUFM沉默后在體外對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的影響。結(jié)果顯示干擾組細(xì)胞遷移能力明顯降低,尤其是在劃痕后24小時(shí)尤為明顯。Transwell遷移模型是研究腫瘤細(xì)胞體外遷移能力最常用最經(jīng)典的模型。利用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾后T24細(xì)胞的遷移能力,si-TUFM組透過Transwell小室膠質(zhì)膜細(xì)胞數(shù)明顯減少,細(xì)胞遷移能力明顯下降。鏡檢計(jì)數(shù),取上下左右中10個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)膜背面的穿膜細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì),si-TUFM組從Transwell上室遷移過膜的每視野細(xì)胞數(shù)為43.1±9.4,陰性對(duì)照組每視野細(xì)胞數(shù)為222.2±26.1,空白對(duì)照組每視野細(xì)胞數(shù)為214.3±22.8,si-TUFM組染色細(xì)胞明顯少于對(duì)照組和陰性對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),三組細(xì)胞干擾后72小時(shí)候,顯微鏡下拍照見干擾組細(xì)胞密度明顯減少,細(xì)胞體積縮小,死細(xì)胞明顯增多。進(jìn)一步行DeadEnd TM比色法凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示干擾組呈棕褐色的細(xì)胞明顯多于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,DeadEndTM比色法凋亡檢測(cè)系統(tǒng)可以對(duì)凋亡細(xì)胞的降解DNA進(jìn)行末端標(biāo)記,該系統(tǒng)以改進(jìn)的TUNEL方法為基礎(chǔ)(TUNEL為TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法)。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干擾組凋亡率為19.5%±3.9%,明顯高于陰性對(duì)照組5.8%±1.8%和空白對(duì)照組2.09%±1.1%(P0.05),陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞周期阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三組間細(xì)胞的細(xì)胞周期未見明顯差異。 結(jié)論 TUFM的表達(dá)在浸潤性尿路上皮癌組高于非浸潤性尿路上皮癌組,而且,高級(jí)別尿路上皮癌組高于低級(jí)別尿路上皮癌,TUFM的表達(dá)隨著膀胱癌組織的病理分級(jí)升高而升高。浸潤性膀胱癌細(xì)胞株的TUFM表達(dá)明顯高于正常膀胱上皮細(xì)胞。沉默TUFM基因后,細(xì)胞增殖能力下降、遷移能力減低、細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡增加。TUFM基因可能與膀胱癌的發(fā)生與進(jìn)展相關(guān),TUFM或許可作為膀胱癌基因治療的基因靶點(diǎn)。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.14

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳萬青;鄭榮壽;張思維;趙平;;2003～2007年中國癌癥發(fā)病分析[J];中國腫瘤;2012年03期

2 溫登瑰;單保恩;張思維;鄭榮壽;王寒松;張莉梅;畢學(xué)娟;陳萬青;;2003—2007年中國腫瘤登記地區(qū)膀胱癌的發(fā)病與死亡分析[J];腫瘤;2012年04期

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本文編號(hào)：2485155