【摘要】：研究背景 膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢,嚴(yán)重威脅人類健康。根據(jù)其浸潤深度,主要分為淺表性膀胱癌及浸潤性膀胱癌,其中尿路上皮癌約占90%[1]。膀胱腫瘤的治療手段仍然采用手術(shù)為主放化療為輔的治療方案,但其療效仍不確定,診斷為浸潤性BCa患者術(shù)后2年內(nèi)約有50%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,5年生存率僅有27%-50%,因發(fā)生轉(zhuǎn)移而未能及時手術(shù)切除,其中位生存期為7-20個月[2]。膀胱癌的早期診斷及術(shù)后復(fù)發(fā)成為影響治愈率及改善患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵因素。目前,評估膀胱癌患者腫瘤進展及預(yù)后主要是根據(jù)術(shù)后病理分級及臨床分期[3]。然而,由于在相同病理分級及臨床分期的膀胱癌患者中,呈現(xiàn)多樣化的臨床預(yù)后。這可能與腫瘤相關(guān)基因表達差異相關(guān),而膀胱癌分子生物學(xué)的發(fā)展及靶向基因的發(fā)現(xiàn)將為膀胱癌提供新的治療策略。通過對人體的遺傳物質(zhì)進行修正、補充或改造,即可達到治療疾病的目的,即“基因治療”(gene therapy)。隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的進展以及基因的發(fā)現(xiàn),人類基因治療已成為現(xiàn)實。在膀胱腫瘤基因治療的研究上,人們也取得了許多重要的成果。近年來,線粒體蛋白質(zhì)翻譯延伸因子Tu(mitochondrial Tu translation elongation factor, TUFM)在腫瘤發(fā)生進展中的作用及機制逐漸成為研究熱點。運用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,發(fā)現(xiàn)TUFM基因在人膀胱癌[4]、胃癌[5]、胰腺癌[6-7]、結(jié)直腸癌[8]、食管鱗狀細胞癌[9]、卵巢癌[10]等腫瘤細胞株或組織中呈高表達,其中TUFM的表達水平與胃癌及結(jié)直腸癌的臨床分期和預(yù)后相關(guān)。TUFM蛋白在胃腺癌組織中不表達或低表達的患者臨床分期一般較高,術(shù)后生存率較低,預(yù)后較差[8]；而結(jié)直腸癌組織中TUFM高表達的患者進展較快,5年內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)率較高[9],提示在TUFM在不同腫瘤中表達不同,從而得出了不同的結(jié)論。盡管相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)TUFM蛋白在大部分腫瘤中呈高表達,并與胃癌和結(jié)直腸癌臨床預(yù)后相關(guān),但其在腫瘤發(fā)生進展中的作用機制及該蛋白對腫瘤細胞生物學(xué)特性的影響仍不清楚。而且,TUFM在膀胱癌中的表達及其對膀胱癌細胞生物學(xué)功能特性的影響并不清楚。本研究首次探討TUFM基因在膀胱癌中的表達,成功建立TUFM低表達細胞系,之后通過相關(guān)方法檢測,進一步研究了沉默TUFM基因后對膀胱癌細胞株生物特性的影響。 研究目的 探討TUFM基因在膀胱癌組織及細胞中的表達,探討靶向沉默TUFM基因后對膀胱癌T24細胞生物功能的影響。 方法 本研究分為兩部分： 一、檢測TUFM基因在膀胱癌組織及細胞中的表達 1. TUFM基因在膀胱癌患者組織標(biāo)本中的表達檢測 膀胱癌及其配對癌旁正常組織來自在南方醫(yī)院泌尿外科住院行TURBT或膀胱癌根治術(shù)的患者,經(jīng)南方醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),獲得患者知情同意。取得的膀胱上皮粘膜組織標(biāo)本經(jīng)南方醫(yī)院病理科鑒定證實為膀胱尿路上皮癌組織,然后小組織放入凍存管,放入液氮后,-80℃冰箱保存?zhèn)溆�。根�?jù)病理診斷分為浸潤性尿路上皮癌組、高級別非浸潤性尿路上皮癌組、低級別非浸潤性尿路上皮癌組和癌旁組織組,應(yīng)用免疫組化和實時定量PCR檢測27例膀胱癌及癌旁組織中TUFM的表達水平,研究其與病理分級、臨床分期之間的相關(guān)性。 2. TUFM基因在膀胱癌細胞及膀胱上皮永生化細胞中的表達檢測 收集兩株人源膀胱癌細胞(T24、UMUC-3)和膀胱上皮永生化細胞SV-HUC-1,用TRIzol提取總RNA,去DNA,逆轉(zhuǎn)錄,實時定量PCR檢測三株細胞中TUFM的表達水平,比較兩株人源膀胱癌細胞與膀胱上皮永生化細胞的表達差異,并據(jù)此選取細胞株進一步研究。 二、沉默TUFM基因后對膀胱癌T24細胞生物功能影響的檢測 1.TUFM基因低表達細胞系的建立及轉(zhuǎn)染效率的檢測。 選取對數(shù)生長期的T24細胞株分為三組,分別為干擾組、陰性對照組、空白對照組,其中干擾組用RNAi的方法,應(yīng)用脂質(zhì)體Lipo2000,將特異性siRNA干擾片段轉(zhuǎn)入細胞,沉默膀胱癌T24細胞TUFM基因的表達；陰性對照組細胞用相同方法轉(zhuǎn)染陰性對照片段；空白對照組則不作任何處理。48小時后用實時定量PCR檢測干擾及陰性對照組干擾片段的轉(zhuǎn)染效率。 2.沉默TUFM基因后對膀胱癌T24細胞增殖、遷移、凋亡及細胞周期的檢測。 MTT法檢測T24細胞的增殖。應(yīng)用MTT實驗檢測三組細胞的抑制率,繪制細胞生長曲線,評價沉默TUFM基因后對T24細胞增殖能力的影響。劃痕實驗和Transwe11遷移實驗檢測各組細胞的遷移能力,評價沉默TUFM基因后對T24細胞遷移能力的影響。選用Annexin V-FITC細胞凋亡實驗和DeadEnd TM比色法凋亡檢測轉(zhuǎn)染后T24細胞的凋亡。流式檢測儀檢測轉(zhuǎn)染后T24細胞周期的影響。 結(jié)果 第一部分 1.共收集膀胱癌組織標(biāo)本27例,浸潤性尿路上皮癌組7例、高級別非浸潤性尿路上皮癌組7例、低級別非浸潤性尿路上皮癌組13例和癌旁組織組9例。全部標(biāo)本均經(jīng)南方醫(yī)院病理科證實為膀胱尿路上皮癌,其中男性19例,女性8例,年齡32-81歲,中位年齡64歲。臨床病理分期按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)中TNM標(biāo)準(zhǔn)：≤T1期：20例,T1期：7例。免疫組化的結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,膀胱癌組織中TUFM高表達,呈胞漿染色;TUFM的表達浸潤性尿路上皮癌組高于非浸潤性尿路上皮癌組,而且,高級別尿路上皮癌組高于低級別尿路上皮癌。熒光定量PCR結(jié)果顯示組織中TUFM的mRNA水平隨著膀胱癌組織的病理分級升高而升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),其中浸潤性尿路上皮癌表達最高,癌旁組織組表達最低。 2.實時定量PCR結(jié)果顯示,兩株人源浸潤性膀胱尿路上皮癌細胞株(T24、UMUC3)中TUFM基因表達明顯高于膀胱上皮永生化細胞(SV-HUC-1),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),其中T24細胞的TUFM基因表達量最高。 第二部分 1.由于T24細胞的TUFM基因表達最高,我們選取T24細胞來研究TUFM基因?qū)毎锾匦缘挠绊憽＿x取對數(shù)生長期的T24細胞株分為三組,分別為干擾組、陰性對照組、空白對照組,應(yīng)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細胞后,將50umo1/L的特異性siRNA轉(zhuǎn)染入T24細胞,48小時后,分別用實時定量PCR檢測干擾及陰性對照組干擾片段的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示：干擾組(si-TUFM組)的TUFM表達明顯低于陰性對照組和空白對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),陰性對照組與空白對照組之間的TUFM表達比較無顯著差異,提示我們已經(jīng)成功建立TUFM低表達膀胱癌細胞系 2.MTT法檢測T24細胞的增殖能力結(jié)果顯示,干擾組細胞增殖抑制率隨著轉(zhuǎn)染時間增加而增高,在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h、96h,細胞增殖抑制率波動在9.5%±1.4%到22.7%±1.2%的范圍。將50nmol/L的siRNA-TUFM和siRNA-NC干擾48小時后T24細胞劃痕實驗檢測在0、12和24小時三個時間點觀察三組細胞向中線遷移的距離及細胞數(shù),觀察TUFM沉默后在體外對細胞運動性的影響。結(jié)果顯示干擾組細胞遷移能力明顯降低,尤其是在劃痕后24小時尤為明顯。Transwell遷移模型是研究腫瘤細胞體外遷移能力最常用最經(jīng)典的模型。利用Transwell遷移實驗檢測干擾后T24細胞的遷移能力,si-TUFM組透過Transwell小室膠質(zhì)膜細胞數(shù)明顯減少,細胞遷移能力明顯下降。鏡檢計數(shù),取上下左右中10個高倍視野計數(shù)膜背面的穿膜細胞進行統(tǒng)計,si-TUFM組從Transwell上室遷移過膜的每視野細胞數(shù)為43.1±9.4,陰性對照組每視野細胞數(shù)為222.2±26.1,空白對照組每視野細胞數(shù)為214.3±22.8,si-TUFM組染色細胞明顯少于對照組和陰性對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),三組細胞干擾后72小時候,顯微鏡下拍照見干擾組細胞密度明顯減少,細胞體積縮小,死細胞明顯增多。進一步行DeadEnd TM比色法凋亡檢測結(jié)果顯示干擾組呈棕褐色的細胞明顯多于陰性對照組和空白對照組,DeadEndTM比色法凋亡檢測系統(tǒng)可以對凋亡細胞的降解DNA進行末端標(biāo)記,該系統(tǒng)以改進的TUNEL方法為基礎(chǔ)(TUNEL為TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法)。Annexin V-FITC細胞凋亡實驗結(jié)果顯示,干擾組凋亡率為19.5%±3.9%,明顯高于陰性對照組5.8%±1.8%和空白對照組2.09%±1.1%(P0.05),陰性對照組和空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。細胞周期阻滯實驗結(jié)果顯示三組間細胞的細胞周期未見明顯差異。 結(jié)論 TUFM的表達在浸潤性尿路上皮癌組高于非浸潤性尿路上皮癌組,而且,高級別尿路上皮癌組高于低級別尿路上皮癌,TUFM的表達隨著膀胱癌組織的病理分級升高而升高。浸潤性膀胱癌細胞株的TUFM表達明顯高于正常膀胱上皮細胞。沉默TUFM基因后,細胞增殖能力下降、遷移能力減低、細胞誘導(dǎo)凋亡增加。TUFM基因可能與膀胱癌的發(fā)生與進展相關(guān),TUFM或許可作為膀胱癌基因治療的基因靶點。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.14

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陳萬青;鄭榮壽;張思維;趙平;;2003～2007年中國癌癥發(fā)病分析[J];中國腫瘤;2012年03期

2 溫登瑰;單保恩;張思維;鄭榮壽;王寒松;張莉梅;畢學(xué)娟;陳萬青;;2003—2007年中國腫瘤登記地區(qū)膀胱癌的發(fā)病與死亡分析[J];腫瘤;2012年04期

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本文編號：2485155