【摘要】：研究背景不孕不育一直是困擾全世界的醫(yī)學難題,在不孕不育的夫妻中,男性因素約占50%,而夫妻雙方因素僅占20%。其中,世界衛(wèi)生組織將男性不育定義為：夫婦同居1年以上,在未采用任何避孕措施的條件下,由于男方因素造成女方不孕者,稱為男性不育。近年來研究發(fā)現(xiàn)男性不育已成為影響人們生活質量的重大疾病之一,其發(fā)病率近年來出現(xiàn)了明顯的增長趨勢。目前研究發(fā)現(xiàn)影響男性不育發(fā)生的原因較多,包括環(huán)境毒物、內分泌功能紊亂、生殖道炎癥、射精障礙、營養(yǎng)不育、精索靜脈曲張、隱睪、生精管道梗阻及遺傳缺陷(基因突變及染色體異常)等。其中,各種病因導致的無精子癥是影響男性不育的重要因素之一。依據無精子癥發(fā)生的病理學改變,目前主要分為兩大類,一類是由于睪丸本身原因引起的生精功能障礙,如染色體異常及基因突變、內分泌紊亂等導致的睪丸生精功能障礙,使正常精子的發(fā)生受阻,造成男性不育,稱為非梗阻性無精癥。另一類類是睪丸的生精功能正常,但輸精管道發(fā)生梗塞,導致正常精子不能排出體外而引起不育,稱為梗阻性無精癥。然而,目前無精癥患者的治療方法及效果并不令人滿意。患者為了明確不育的病因及病理,往往需要接受多次精液分析、常規(guī)前列腺液檢查、內分泌檢查、多普勒超聲檢查、甚至睪丸活檢和染色體核型分析等,這些檢查方法耗時長,花費較大,有時候仍不能獲得明確的診斷,多數(shù)不育患者最終只能選擇人工輔助生殖技術。顯然,無精子癥臨床診斷方式的突破及治療方法的改善有賴于基礎研究的重大進展,有賴于無精癥發(fā)生機制的闡明。近年來研究發(fā)現(xiàn)遺傳性因素是導致男性不育的重要原因之一,大約有15%的男性不育癥是由于遺傳性因素引起,包括染色體異常和單基因突變,其中染色體異常占2%-8%,平均為5%。Y染色體微缺失是導致精子發(fā)生障礙,引起男性不育的一個重要病因,1976年Luciiano Tiepolo和Orsetta Zuffardi首先提出與精子生成障礙密切相關的Y染色體長臂上無精子癥因子概念；1998年Vogt進一步將無精子癥因子定位于Yqll,稱這種缺失為Y染色體微缺失。無精子癥因子由近至遠包含3個不同的亞區(qū)：位于Yq11.21的AZFa,,位于Yq11.23的AZFb和AZFc。同時,近年研究發(fā)現(xiàn)X常染色體易位、基因的突變或缺失也是導致男性不育的重要因素,其中AR, SOX3, USP26, NXF2, TAF7L, FATE及AKAP4等位于X染色體的基因已被證實與精子的發(fā)生障礙密切相關。PGAM1為PGAM家族成員之一,與PGAM2高度同源,然而,由于PGAM1具有較多的基因拷貝數(shù),因此把PGAM1作為PGAM2的祖基因。PGAM1是糖酵解途徑中的重要酶之一,主要催化3-磷酸甘油酸生成2-磷酸甘油酸,最終成為磷酸烯醇式丙酮酸。目前相關研究發(fā)現(xiàn)PGAM1表達于正常的腦、肝及腎等組織,其表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生相關。然而,其表達與男性不育的研究尚未曾報道過。我們課題組在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)PGAM1蛋白可能為與男性不育相關的新型候選蛋白,為進一步研究PGAM1表達與男性不育的關系,我們開展了本研究。目的1.探討PGAM1在人不同類型睪丸組織中的表達及其臨床意義。2.探討PGAM1在生精功能不良動物模型中的表達及其意義。3.探討PGAM1的生物學功能及相關作用機制。方法1.收集40例不同組織學類型的睪丸組織(生精功能正常10例,輕度生精功能不良10例,重度生精功能不良10例,唯支持細胞綜合征10例),經固定、脫水制成石蠟組織塊,采用免疫組化檢測PGAM1在不同組織學類型睪丸組織中的表達情況,并分析PGAM1表達與臨床病理參數(shù)的關系。2.收集8例不同組織學類型的新鮮睪丸組織標本(生精功能正常2例,輕度生精功能不良2例,重度生精功能不良2例,唯支持細胞綜合征2例),經組織研磨提取RNA,采用qRT-PCR定量檢測PGAMmRNA表達水平,并分析其表達與臨床病理特征的關系。3.挑選10只6W大的C57雄性小鼠,體重約為19-21g,隨機分為實驗組及對照組。其中,實驗組采用白消安(30 mg/kg)及二甲基亞砜(DMSO)進行腹腔單次注射,構建生精功能不良的C57動物模型,對照組僅注射等體積的DMSO。注射后2w,全部處死小鼠,收集小鼠睪丸組織。睪丸組織經脫水、包埋做成石蠟組織。石蠟組織經切片、脫水及脫蠟后行蘇木素-伊紅(HE)染色,觀察睪丸組織的形態(tài)學改變。同時,通過qRT-PCR及Western blot檢測實驗組及對照組睪丸組織中PGAM1的表達情況,分析睪丸生精功能與PGAM1表達的關系。4.首先通過qRT-PCR檢測PGAM1mRNA在小鼠精原細胞株GC1、小鼠精母細胞株GC2及支持細胞株TM4中的表達水平,然后通過siRNA干擾技術瞬時轉染敲低GC1及TM4中PGAM1mRNA的表達水平,并通過qRT-PCR及Western blot進行驗證。5.通過MTT實驗分別檢測PGAM1表達下調對GC1及TM4細胞增殖能力的影響；通過流式細胞儀分別檢測PGAM1表達下調對GC1及TM4細胞凋亡的影響；通過劃痕實驗分別檢測PGAM1表達下調對GC1及TM4細胞運動能力的影響。6.采用免疫組化及Western blot檢測PGAM1表達下調后下游凋亡相關蛋白Caspase 6及caspase 9、抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平,初步探討PGAM1的分子機制。結果1.免疫組化檢測PGAM1在不同組織學類型睪丸組織中的表達免疫組化檢測結果表明PGAM1陽性表達于生精功能正常的睪丸組織,主要定位于精原細胞、精母細胞及支持細胞的胞核及胞質中,而精子細胞中無明顯陽性表達。其中,在40例不同類型睪丸組織中,PGAM1在生精功能正常、輕度生精功能不良、重度生精功能不良及唯支持細胞綜合征中的高表達率分別為90%(9/10),80%(8/10),10%(1/10),100%(10/10),組內比較,差異具有明顯統(tǒng)計學意義(P=0.000)。然而,其表達與患者的年齡、睪丸體積、FSH、LH及T水平均無明顯相關(P0.05)。2. qRT-PCR檢測PGAM1在不同類型睪丸組織中的表達為進一步探討PGAM1表達與睪丸生精功能的關系,我們通過qRT-PCR定量檢測了PGAM1在生精功能正常、輕度生精功能不良、重度生精功能不良及唯支持細胞綜合征睪丸組織中的表達水平,結果提示PGAM1mRNA水平在生精功能正常睪丸組織中的表達明顯高于重度生精不良,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。結果也顯示PGAM1mRNA水平與患者的年齡、睪丸體積、FSH、LH及T水平均無明顯相關(P0.05)。3. PGAM1在生精功能不良動物模型中的表達為驗證白消安單次腹腔注射后,是否能影響睪丸的生精功能,我們通過HE染色觀察了實驗組與對照組睪丸的形態(tài)學改變。結果所示,對照組睪丸組織中的生精小管結構清晰,生精小管內生精細胞的排列及層次整齊,可見到大量成熟的精子集中于生精小管的中間管腔,提示DMSO注射并沒有影響睪丸的生精功能；與對照組相比,我們發(fā)現(xiàn)在經白消安注射后的實驗組小鼠睪丸組織中,生精小管發(fā)生明顯的變形,并出現(xiàn)萎縮,生精小管內生精細胞排列紊亂,各級生精細胞(精原細胞、精母細胞、精子細胞及精子)均明顯減少,提示經白消安注射后睪丸組織出現(xiàn)了明顯的生精功能不良,睪丸生精功能不良的小鼠動物模型構建成功。隨后,我們通過免疫組化檢測了PGAM1的表達情況,結果顯示PGAM1在生精功能正常的睪丸組織中陽性表達于生精小管中的精原細胞、精母細胞、精子細胞及支持細胞的胞核及胞漿,同時也陽性表達于間質細胞的胞核及胞漿。然而,PGAM1在生精功能低下的睪丸生精小管中的表達明顯減弱。qRT-PCR定量檢測結果顯示PGAM1在生精功能不良的睪丸組織中的表達明顯低于對照組生精功能正常的睪丸組織,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。同時,Western blot定量檢測結果也顯示PGAM1在生精功能不良的睪丸組織中的表達明顯低于對照組生精功能正常的睪丸組織,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4. PGAM1表達下調對GC1及TM4生物學功能的影響首先,我們通過qRT-PCR定量檢測了PGAM1在小鼠精原細胞株(GC1)、小鼠精母細胞株(GC2)及小鼠支持細胞(TM4)中的表達情況,結果顯示PGAM1在GC1及TM4細胞株中的表達高于GC2。細胞免疫組化結果顯示PGAM1在GC1、GC2、TM4細胞株中表達主要定位于細胞質,其中PGAM1在GC1及TM4細胞中的陽性表達強于GC2。同時,免疫熒光結果也表明PGAM1主要定位于細胞質,PGAM1在GC1及TM4細胞中的陽性表達強于GC2細胞。隨后,為了進一步明確PGAM1的生物學功能,我們采用siRNA干擾技術瞬時轉染敲低PGAM1mRNA在GC1及TM4細胞株中的表達水平,依據qRT-PCR實驗篩選出干擾效果最佳的干擾片段進行后續(xù)實驗,并采用Western blot進行驗證。結果表明：針對PGAM1表達設計的三條干擾片段在GC1細胞中,下調PGAM1mRNA的水平分別為24.7%、78.0%、32.0%。其中,與對照組相比,干擾片段2的干擾效果最佳,差異明顯,具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。在TM4細胞中,三條干擾片段下調PGAM1mRNA的水平分別為11.0%、84.0%、31.3%。與對照組相比,干擾片段2的干擾效果也是最佳,差異明顯,具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。為此,我們選擇干擾片段2進行后續(xù)的研究。隨后,我們采用Western blot分別檢測了干擾片段2在GC1及TM4細胞中對PGAM1的干擾效果,結果顯示經干擾片段2轉染后,PGAM1表達明顯下調。為探討PGAM1表達下調對GC1及TM4細胞增殖能力的影響,我們進行了MTT實驗。結果表明在GC1細胞中,PGAM1表達下調后細胞的生長曲線較平緩,OD值明顯較低,提示PGAM1表達下調后GC1細胞的增殖能力明顯減弱(P=0.000)。同時,在TM4細胞中,PGAM1表達下調后,細胞的生長曲線與對照組相比,也較平緩,OD值明顯低于對照組,提示PGAM1表達下調后TM4細胞的增殖能力明顯減弱(P=0.000)。為探討PGAM1表達下調對GC1及TM4細胞凋亡能力的影響,我們采用流式細胞儀檢測了細胞的凋亡率。結果顯示：對照組GC1細胞的凋亡為2.1%±0.5%,而PGAM1表達下調后GC1細胞的凋亡率為11.8%±1.5%,明顯高于對照組,差異明顯,具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。同時,對照組TM4細胞的凋亡為8.7%±2.4%,而PGAM1表達下調后GC1細胞的凋亡率為18.1%±3.9%,明顯高于對照組,差異明顯,具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。為探討PGAM1表達下調對GC1及TM4細胞運動能力的影響,我們進行了劃痕實驗。結果表明PGAM1表達下調后24h,TM4細胞的遷移距離明顯低于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000),提示PGAM1表達下調明顯抑制了TM4細胞的遷移。然而,PGAM1表達下調后24h,GC1細胞的遷移距離無明顯變化,差異無明顯統(tǒng)計學意義(P=0.786),提示PGAM1表達下調明對GC1細胞的遷移能力無明顯影響。5. PGAM1表達下調對下游凋亡相關蛋白表達的影響為探討PGAM1發(fā)揮生物學功能的潛在機制,我們通過Western blot檢測了PGAM1表達下調后,凋亡相關蛋白Caspase 6及Caspase 9的表達情況,同時也檢測了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達情況。結果表明,PGAM1表達下調后Caspase 6及Caspase 9表達均出現(xiàn)明顯上調,而Bcl-2表達出現(xiàn)明顯下調,提示PGAM1的表達下調激活了Caspases及Bcl-2信號通路。結論1. PGAM1陽性表達于生精功能正常的睪丸組織,其表達下調可能引起睪丸生精能力的減弱。2. PGAM1表達與生精細胞的增殖、凋亡及遷移能力相關；其中,PGAM1表達下調能明顯抑制GC1及TM4細胞的增殖,也能明顯抑制TM4細胞的遷移,同時有助于GC1及TM4細胞的凋亡。3. PGAM1發(fā)揮生物學功能的機制與其表達下調激活了Caspases及Bcl-2信號通路有關。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R698.2
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本文編號：
2482028
