【摘要】：研究目的 我們曾獲得一經(jīng)臨床及病理證實的家族遺傳性局灶節(jié)段性腎小球硬化癥（fami-lial focal and segmental glomerulosclerosis, FFSGS）大家系，在國家自然基金的資助下，對包括5代共54名成員在內(nèi)的所有人員（未出現(xiàn)腎臟疾病的成員和FFSGS患者）進行連鎖分析及全外顯子測序（與深圳華大基因研究院合作），獲得其致病基因為STRIP1（striatin interacting protein1）。并且經(jīng)過初步體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)在膜性腎病大鼠模型PHN、微小病變大鼠模型PAN這些典型足細胞病動物模型中，大鼠腎臟的strip1表達量增高，并且隨建模時間的延長而增加。 為研究STRIP1是否與足細胞病變有關，是否會通過影響細胞形態(tài)和骨架結構導致足細胞功能的改變，我們以MPC（mouse podocyte clones，小鼠足細胞克�。┘毎禐榛A，探究小鼠野生型Strip1在足細胞中的功能和突變型Strip1的致病機制。本實驗將從足細胞形態(tài)、骨架和Strip1相關蛋白等方面研究Strip1的功能作用機制，為未來診斷和治療相關的足細胞疾病提供新的思路和依據(jù)。 研究方法 通過構建Strip1基因沉默，野生型過表達和突變型過表達小鼠腎臟足細胞模型，研究Strip1在小鼠足細胞中的作用。實驗設計如下：①針對小鼠Strip1基因設計干擾靶點、合成RNAi序列構建干擾腺病毒；②構建小鼠Strip1基因野生型和突變型過表達腺病毒；③用腺病毒感染完全分化成熟的MPC細胞，構建沉默、野生型和突變型過表達等細胞模型；④通過細胞免疫熒光、qPCR和western blotting觀察Strip1基因的功能；⑤通過細胞免疫熒光、qPCR和western blotting觀察突變型strip1在小鼠腎臟足細胞中的作用。 結果 成功構建小鼠Strip1基因的RNAi、野生型和突變型過表達載體腺病毒：①所有構建載體（包括RNAi、野生型和突變型）的目的片段序列正確；②試感染MPC細胞，所有腺病毒均可表達，效果非常理想（P0.01）；③獲得滴度高達1011TCID50/ml的三種目的腺病毒。 成功構建小鼠Strip1基因的RNAi、野生型過表達足細胞模型，觀察Strip1對小鼠足細胞的作用： 通過細胞免疫熒光觀察，①strip1蛋白表達量降低時，細胞形態(tài)改變，邊緣不規(guī)則，足突結構改變，外伸足突伸展不足。F-actin和α-tubulin分布紊亂；②當strip1蛋白表達量顯著增高時，細胞變大變圓，邊緣改變，足突結構破壞，偽足樣足突伸展形態(tài)改變。F-actin明顯邊緣化，排列成了一個又大又圓的球形，邊緣明亮，中間斷續(xù)，α-tubulin完全失去了規(guī)則的排列方式；③Strip1表達量改變時，nephrin表達量變少；④ARP2和CTTNBP2的分布也發(fā)生了改變，部分strip1過表達細胞的細胞核變大變圓，ARP2在核周的分布形成了一個不完整的環(huán)形。 通過western blotting發(fā)現(xiàn)：在完全分化的終末分化MPC細胞中，①F-actin和α-tubulin表達量隨strip1變化；②nephrin隨Strip1變化表達量降低。 通過Real time PCR發(fā)現(xiàn)：F-actin和α-tubulin mRNA的變化與趨勢相同（P＜0.05）。 成功構建突變型Strip1基因過表達足細胞模型，觀察突變型Strip1對小鼠足細胞的作用： 通過細胞免疫熒光觀察，①突變的strip1蛋白在細胞內(nèi)表達，，細胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變，邊緣伸展的足突結構異常，細胞邊緣明顯不規(guī)則。F-actin和α-tubulin的分布均隨細胞形態(tài)的改變而化變，F(xiàn)-actin分布更加邊緣化，α-tubulin也失去了正常的排列；②nephrin表達減少。 通過western blotting發(fā)現(xiàn)：突變細胞膜型中，①F-actin表達量增高；②nephrin表達量降低。 通過Real time PCR發(fā)現(xiàn)：F-actin mRNA的變化與趨勢相同（P＜0.05），Arp2mRNA表達量降低（P＜0.05）。 結論 Strip1影響小鼠腎臟足細胞的骨架排列，它的異常會導致肌動骨架蛋白F-actin和微管蛋白α-tubulin的分布和表達異常，細胞正常形態(tài)消失，足突結構破壞，Strip1可能通過影響CTTNBP2的蛋白修飾影響細胞的骨架蛋白排列。且Strip1表達異常時，有F-actin支撐固定于裂孔隔膜的功能蛋白nephrin丟失，從而導致足細胞功能的損傷。 突變型Strip1影響足細胞骨架結構和分布，細胞形態(tài)改變，足突結構消失，裂孔隔膜的功能蛋白nephrin丟失。實驗結果顯示，發(fā)生突變的Strip1與F-actin相互作用，可能通過Arp2影響nephrin的表達。 綜上所述，Strip1基因對維持足細胞正常形態(tài)和功能起重要作用，改變F-actin分布以致影響骨架分布，結構消失，使裂孔隔膜處錨定nephrin的丟失。該基因的此位點突變可能與足細胞病發(fā)生有關，且主要與足突結構消失和nephrin減少相關。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R692.6

【參考文獻】

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本文編號：2465217