【摘要】：目的： 觀察小檗堿（berberine, BBR）對不同階段DN大鼠腎功能的保護作用，明確BBR在DN不同階段對大鼠腎臟功能及組織病變的作用特點；通過檢測在DN不同階段時腎組織中PGE2、EP4、Gαs、cAMP的表達情況及BBR對他們的調(diào)控，來揭示BBR對DN大鼠腎臟功能發(fā)揮保護作用的相關(guān)機制。 方法： 采用高糖高脂飲食合并小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）來誘導DN大鼠模型。腹腔注射STZ72h后測定大鼠空腹血糖值,以血糖值≥11.1mol/L納入實驗,動物被隨機分成正常對照組、模型組、3個BBR給藥組（50、100、200mg/kg）、依那普利、二甲雙胍、辛伐他汀陽性藥對照組。采用灌胃給藥（intragastric administration,ig）每天一次并繼續(xù)喂以高糖高脂飼料，分別在2，4，6，8周觀察大鼠的一般狀況，體重每周一次稱重，血糖每兩周一次測量。在不同階段分別將大鼠置于代謝籠中，收集24h尿液；于股動脈采血后分離血清，分別檢測大鼠的24h尿蛋白總量（totalurine protein for24hours, UP24h）、尿肌酐（urine creatinine, UCr）、血尿素氮（bloodurea nitrogen, BUN）、血肌酐（serum creatinine, Scr）、總膽固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride, TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low densitylipoprotein-cholesterol, LDL-c）、極低密度脂蛋白膽固醇（very low densitylipoprotein-cholesterol, VLDL-c）、高密度脂蛋白膽固醇（high densitylipoprotein-cholesterol, HDL-c）。在不同階段分別取出大鼠腎臟并稱重，計算其相對腎重（腎重/體重，KW/BW）；觀察HE染色后腎臟組織病理學變化；免疫組織化學法檢測腎皮質(zhì)中轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor β1, TGF-β1)；Westernblotting法檢測腎皮質(zhì)中EP4、Gαs蛋白表達水平；ELISA法檢測腎組織中前列腺素E2（protaglandin E2, PGE2）和白細胞介素18（interleulkin-18, IL-18）的水平；放射免疫法檢測腎組織中cAMP和胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor1, IGF-1)的水平。 結(jié)果： 1BBR對不同階段DN大鼠血糖和體重的影響 DN模型組大鼠的血糖水平較正常組顯著升高, BBR（100mg/kg,200mg/kg）從給藥第6周開始,血糖較模型組顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）；而BBR（50mg/kg）給藥對DN大鼠血糖沒有明顯影響；二甲雙胍治療組從2周開始也可顯著降低模型組的血糖水平。 模型組大鼠的體重從第2周開始較正常對照組明顯降低；BBR給藥組及依那普利、二甲雙胍和辛伐他汀治療組在給藥后，對模型組大鼠的體重均無明顯影響。 2BBR對不同階段DN大鼠腎功能指標及血生化指標的影響 在不同階段，模型組大鼠的KW/BW比值、UCr、總蛋白/尿肌酐比值（UTP/C）、SCr、BUN、TG、TC、LDL-c、VLDL-c水平較正常對照組均明顯升高，而HDL-c水平明顯降低；從4周開始，BBR（200mg/kg）可明顯改善DN大鼠的腎功能和血生化指標的異常，而BBR（100mg/kg）具有顯著改善作用是從6周開始，BBR（50mg/kg）則沒有明顯的改善作用。 3BBR對不同階段DN大鼠腎臟組織病理學的影響 與正常組腎臟相比，模型組大鼠腎小球體積明顯增大，，基底膜明顯增厚，部分腎小球已硬化，腎小管上皮細胞部分伴有大量炎性細胞浸潤。3個BBR給藥組在2周時對模型組大鼠病變的腎臟無明顯影響；而從4周開始BBR（200mg/kg）可明顯改善大鼠的病理變化；陽性藥治療組對模型組大鼠腎臟也有類似的改善作用。 4BBR對DN大鼠腎組織中TGF-β1表達的影響 免疫組化結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織中TGF-β1的表達較正常組明顯升高，BBR（100mg/kg,200mg/kg）可顯著降低模型大鼠腎皮質(zhì)中TGF-β1的表達。 5BBR對不同階段DN大鼠腎臟IL-18表達的影響 ELISA法結(jié)果顯示，模型組大鼠IL-18水平較正常組顯著升高。BBR（200mg/kg）從4周開始可明顯降低IL-18水平并具有統(tǒng)計學意義，BBR（100mg/kg）從6周開始可明顯降低IL-18水平并具有統(tǒng)計學意義，而BBR（50mg/kg）對IL-18的表達水平并無明顯影響。 6BBR對不同階段DN大鼠腎臟IGF-1水平的影響 放免法結(jié)果顯示，在各階段模型組大鼠IGF-1水平較正常組明顯升高。BBR（200mg/kg）從4周開始可明顯下調(diào)IGF-1水平，BBR（100mg/kg）則從6周開始才可明顯下調(diào)IGF-1水平，而BBR（50mg/kg）對DN大鼠腎臟組織中IGF-1的表達水平無明顯影響。 7BBR對不同階段DN大鼠腎臟PGE2表達的影響 ELISA法結(jié)果顯示，在各階段模型組大鼠PGE2水平較正常組顯著升高。BBR（200mg/kg）從4周開始可明顯降低腎皮質(zhì)中PGE2的表達水平并具有統(tǒng)計學意義，BBR（100mg/kg）從6周開始可明顯降低腎皮質(zhì)中PGE2的水平并具有統(tǒng)計學意義，而BBR（50mg/kg）對腎皮質(zhì)中PGE2的表達水平并無明顯影響。 8BBR對不同階段DN大鼠腎皮質(zhì)中EP4，Gαs蛋白表達的影響 Western blotting結(jié)果表明，與正常組大鼠比較，模型組大鼠腎皮質(zhì)中EP4、Gαs表達明顯降低，BBR給藥組在不同階段對腎皮質(zhì)中降低的EP4、Gαs蛋白表達水平有不同的影響：從4周開始，BBR（200mg/kg）可明顯上調(diào)DN大鼠腎皮質(zhì)中降低的EP4、Gαs蛋白表達水平，而BBR（100mg/kg）明顯上調(diào)DN大鼠腎皮質(zhì)中降低的EP4、Gαs蛋白表達水平是從6周開始的，BBR（50mg/kg）對DN大鼠腎皮質(zhì)中EP4、Gαs蛋白表達水平無明顯影響。 9BBR對不同階段DN大鼠腎臟cAMP含量的影響 放免法結(jié)果顯示，在各階段模型組大鼠cAMP水平較正常組顯著下降。BBR（200mg/kg）從4周開始可明顯上調(diào)cAMP水平，BBR（100mg/kg）則從6周開始才可明顯上調(diào)cAMP水平，而BBR（50mg/kg）對DN大鼠腎臟組織中cAMP的表達水平無明顯影響。 結(jié)論： 1. BBR（100mg/kg,200mg/kg）給藥在不同階段使模型組血糖下降的程度不同； BBR（100mg/kg,200mg/kg）給藥在不同階段對模型組大鼠血生化和腎功能指標的改善有所不同，提示BBR至少應給藥4周以上才可以改善DN大鼠的疾病狀態(tài)。BBR（100mg/kg,200mg/kg）給藥可下調(diào)DN大鼠腎組織中TGF-β1、IL-18、IGF-1和PGE2的表達，提示BBR對DN大鼠腎臟的保護作用可能與其調(diào)節(jié)TGF-β1、IL-18、IGF-1和PGE2等因子有關(guān)。 2. BBR（100mg/kg,200mg/kg）給藥在不同階段調(diào)節(jié)DN大鼠腎皮質(zhì)中EP4、Gαs、cAMP的表達情況不同，BBR（200mg/kg）從第4周開始可明顯上調(diào)腎皮質(zhì)中EP4、Gαs、cAMP的表達，而BBR（100mg/kg）發(fā)揮同樣的作用是從6周開始的，提示BBR可能是通過EP4-Gαs-cAMP信號通路發(fā)揮其對DN大鼠腎臟的保護功能。
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【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R587.2;R692

【參考文獻】

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本文編號：2435907