【摘要】：研究背景:很久以來,精子被認(rèn)為只是運(yùn)送DNA進(jìn)入卵細(xì)胞,而其他組分例如RNA分子只是殘留物、不具有生理功能。近年來的研究進(jìn)展表明,成熟精子中RNA分子可以通過受精方式傳遞給子代、參與調(diào)節(jié)受精卵和胚胎的發(fā)育。精子RNA可分為mRNA(message RNA,信使RNA)和ncRNA(non-coding RNA,非編碼RNA)。迄今,通過microarray和RT-PCR等方法,眾多的mRNAs和長(zhǎng)度小于200個(gè)核苷酸的小ncRNAs已在人和其他哺乳動(dòng)物精子中得到鑒定。然而,哺乳動(dòng)物尤其是人的成熟精子是否存在長(zhǎng)度大于200核苷酸的長(zhǎng)非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、及其可能的功能還遠(yuǎn)未闡明。lncRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有表觀遺傳調(diào)控功能的重要生物大分子,與染色質(zhì)調(diào)控蛋白、RNA結(jié)合蛋白、小RNA等相互作用形成功能復(fù)合體,調(diào)控多個(gè)重要生命過程。例如,已有研究表明睪丸特異性lncRNA對(duì)于雄性生殖至關(guān)重要、關(guān)鍵lncRNA的缺失會(huì)導(dǎo)致雄性不育,提示lncRNA分子異�？赡芘c男性不育密切相關(guān)。男性不育已成為嚴(yán)重影響國(guó)民身心健康的重大疾病,其中以精子運(yùn)動(dòng)能力低下為主要特征的弱精癥占相當(dāng)大的比例,但相關(guān)的病因機(jī)制有待闡明。結(jié)合上述領(lǐng)域內(nèi)研究熱點(diǎn)以及臨床需要,本研究擬回答:人成熟精子中是否存在lncRNA,它的表達(dá)譜是如何?如果人成熟精子內(nèi)存在lncRNA,那么它是否與弱精癥存在相關(guān)性呢,是否導(dǎo)致男性不育的重要因子?通過研究分析lncRNA在人成熟精子中的表達(dá)譜,驗(yàn)證并篩選出一些與弱精癥有相關(guān)性的lncRNA,本課題期待為揭示弱精癥的病因提供科學(xué)依據(jù)、為男性不育的發(fā)病機(jī)制提供新線索。研究方法:收集精子樣本共84例,其中包括36例弱精患者的精子,隨機(jī)12個(gè)捐助者的樣本混勻后均分成三份;48例正常的精子樣本,隨機(jī)12個(gè)捐助者的樣本混勻后均成四份。混合樣品純化后分離提取總RNA,并檢測(cè)其純度和質(zhì)量,最后篩選7個(gè)混合樣品,編號(hào)分別為:NS-1,NS-2,NS-3,NS-4,ATNZ-1,ATNZ-2,ATNZ-3。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,得到lncRNA在人成熟精子中的表達(dá)情況,并篩選出差異表達(dá)顯著lncRNAs(Fold-change2.0,P0.01)。利用GO分析(Gene Ontology,基因本體論)和KEGG通路分析進(jìn)一步研究。我們通過RT-PCR和熒光原位雜交(FISH)證實(shí)lncRNA轉(zhuǎn)錄物在人成熟精子中的存在。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QPCR)進(jìn)行大樣本量驗(yàn)證精子睪丸特異性且差異表達(dá)顯著的lncRNAs。正常組和弱精癥組lncRNAs表達(dá)水平的比較采用Mann-Whitney和雙樣本Kolmogorov-Smirnov兩種非參數(shù)檢驗(yàn)。分析差異表達(dá)lnc RNAs與弱精癥的前向運(yùn)動(dòng)精子率(PR%)之間的相關(guān)性。同時(shí)構(gòu)建出lncRNA與mRNA的共表達(dá)分析網(wǎng)絡(luò),分析預(yù)測(cè)這些差異表達(dá)的lncRNAs的功能和可能的致病機(jī)制。研究結(jié)果:1.在人成熟精子中鑒定了know lncRNA有38,307個(gè)和novel lncRNA有27,472個(gè),并且通過RT-PCR和熒光原位雜交(FISH)在2個(gè)代表性的lncRNA上證實(shí)了lncRNA轉(zhuǎn)錄物的存在。2.正常精子(NS)組和弱精癥(ATNZ)組中,共有2768個(gè)lncRNAs差異表達(dá)(Fold-change2.0,P0.01),其中2445個(gè)lncRNAs表達(dá)上調(diào),323個(gè)lncRNAs表達(dá)下調(diào);共有615個(gè)mRNAs差異表達(dá),其中393個(gè)mRNAs表達(dá)上調(diào),222個(gè)mRNAs表達(dá)下調(diào)。3.GO分析顯示,將mRNA分成3類:生物學(xué)過程類(biological process)、細(xì)胞組分類(cellular component)、分子功能類(molecular function)。其中參與生物過程類基因顯著富集(P0.01),包括:蛋白激酶C-激活,G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路,肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織,RNA代謝過程的調(diào)節(jié),基于肌動(dòng)蛋白絲的過程和細(xì)胞連接組裝。KEGG通路分析顯示,差異表達(dá)的mRNA參與cGMP-PKG信號(hào)通路,NOD樣受體信號(hào)通路,細(xì)胞凋亡等。4.NS組和ATNZ組中,預(yù)測(cè)出差異表達(dá)lncRNA的順式調(diào)控(編碼基因的上游10 kbp序列和lncRNA的下游100 kbp序列)和反式調(diào)控(自由能小于-30kj/mol)的靶基因。結(jié)果顯示,找到lncRNA的靶基因mRNA有13131個(gè)。其GO富集分析表明,這些靶基因參與的生物過程包括:細(xì)胞器官組織,RNA轉(zhuǎn)運(yùn),RNA代謝過程,參與形態(tài)發(fā)生的細(xì)胞成分裝配,肌原纖維組裝,肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)組織,肌動(dòng)蛋白絲重組等過程。KEGG通路分析顯示,差異表達(dá)的lncRNA靶基因參與包括蛋白質(zhì)消化吸收,RNA轉(zhuǎn)運(yùn),肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié),PI3K-Akt信號(hào)通路等途徑。5.篩選得到睪丸精子特異性的lncRNA有48個(gè)。進(jìn)行熒光定量PCR分別進(jìn)行驗(yàn)證,最后得到只有5個(gè)精子睪丸特異表達(dá)的lncRNA,分別為:NONHSAG032058、NONHSAG009522、NONHSAG072018、LXLOC_098487、LXLOC_077183。臨床大樣本(51個(gè)正常樣本和51個(gè)弱精樣本)進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證明,在睪丸精子特異性表達(dá)的LXLOC_098487,NONHSAG009522,NONHSAG072018,NONHSAG032058在弱精癥患者中同時(shí)增加,與測(cè)序結(jié)果相同,表明它們可能共同涉及在調(diào)節(jié)成熟精子功能。6.結(jié)合上述結(jié)果5,LXLOC_098487在弱精癥組和正常組中的表達(dá)水平存在顯著性差異(非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney,P=0.011;非參數(shù)檢驗(yàn)Kolmogorov-Smirnov,P=0.033);NONHSAG009522在弱精癥組和正常組中的表達(dá)水平存在顯著性差異(非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney,P0.001;非參數(shù)檢驗(yàn)Kolmogorov-Smirnov,P0.001);NONHSAG072018在弱精癥組和正常組中的表達(dá)水平存在顯著性差異(非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney,P0.001;非參數(shù)檢驗(yàn)Kolmogorov-Smirnov,P0.001);NONHSAG032058在弱精癥組和正常組中的表達(dá)水平存在顯著性差異(非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney,P=0.030;非參數(shù)檢驗(yàn)Kolmogorov-Smirnov,P=0.037);分析臨床精子樣本中4條lncRNAs和精液基本參數(shù)的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)4個(gè)lncRNAs的表達(dá)水平和前向運(yùn)動(dòng)精子率(Progressive motility,PR,%)無相關(guān)性。7.組織特異性且差異表達(dá)lncRNA:NONHSAG072018,其靶基因?yàn)?NM_001145204(Shisa9)與通道蛋白有關(guān),可能多層次參與調(diào)控通道蛋白的靶基因,并在其中扮演重要的角色。組織特異性且差異表達(dá)NONHSAG009522,NM_015423(AASDHPPT)參與氨基酸合成,泛酸代謝,線粒體代謝等。結(jié)論:1.本研究證實(shí)人成熟精子中存在lncRNAs,以及構(gòu)建人成熟精子lncRNAs表達(dá)譜。該結(jié)果豐富人成熟精子中的RNA類型,為精子RNA功能的深入研究以及對(duì)男性不育等相關(guān)領(lǐng)域產(chǎn)生促進(jìn)作用。2.以上結(jié)果顯示,本研究初步篩選,并鑒定得到5個(gè)精子睪丸特異性且差異表達(dá)lncRNAs,與正常組相比,其中有4個(gè)lncRNAs在弱精中表達(dá)水平均呈上調(diào)趨勢(shì),符合測(cè)序結(jié)果。目前驗(yàn)證的5條候選lncRNAs初步證明與弱精癥PR值無相關(guān)性,但是差異分析顯示,弱精人群和正常人群之間是存在顯著差異,表明lncRNA可能是弱精癥的一個(gè)貢獻(xiàn)因素。由于涉及的樣本量相對(duì)較小,因此得出的結(jié)果需要可靠的,豐富的臨床大樣本及找到更正確的實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)一步來進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)5條候選lncRNAs進(jìn)行RNA-PLEX軟件預(yù)測(cè)出相對(duì)應(yīng)的靶基因,最終其中只有兩條找出靶基因,并進(jìn)行GO分析和KEGG分析顯示,可能多層次參與調(diào)控通道蛋白的靶基因,參與氨基酸合成,泛酸代謝,線粒體代謝等,并在其中扮演重要的角色。該結(jié)果為闡釋弱精癥的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),對(duì)精子發(fā)生和精子功能調(diào)節(jié)的研究具有重要的理論意義。因此,它們很有可能成為“弱精癥相關(guān)分子標(biāo)志群”中的新一員以發(fā)揮其臨床價(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R698.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 樊新愛,蘭勇,周書元;少弱精癥的治療體會(huì)[J];基層醫(yī)學(xué)論壇;2004年11期

2 焦尚清,郭清;治療202例男性少弱精癥療效觀察[J];四川醫(yī)學(xué);2005年02期

3 郭廷超;鄂偉;韓士廣;孟令波;;中藥聯(lián)合鋅硒寶片治療少弱精癥45例觀察[J];山東醫(yī)藥;2007年22期

4 劉振娥;鄭艷梅;;生長(zhǎng)激素治療男性少弱精癥30例[J];河北醫(yī)藥;2007年10期

5 徐璐;熊國(guó)保;胥杜娟;楊霞;;少弱精癥的中西醫(yī)治療現(xiàn)狀與進(jìn)展[J];現(xiàn)代診斷與治療;2009年02期

6 吳鏑;;中西醫(yī)結(jié)合治療男性少弱精癥的臨床療效觀察[J];中華全科醫(yī)學(xué);2012年03期

7 馬曉年;;男性患上弱精癥能懷孕嗎[J];科學(xué)養(yǎng)生;2014年02期

8 武宜婷;楊進(jìn);;少弱精癥的中醫(yī)治療研究進(jìn)展[J];河北中醫(yī);2013年12期

9 ;中醫(yī)能治少弱精癥嗎[J];人人健康;2009年15期

10 豆豆;;弱精癥易擋“子彈”飛[J];健康生活(下半月);2011年07期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 姚榮先;;中西藥結(jié)合治療少弱精癥臨床觀察[A];第5次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合男科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編暨男科提高班講義[C];2007年

2 閆法群;;弱精癥治療的新方法[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)第十一屆男科學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2011年

3 劉建榮;王懷秀;王毅民;馬順峨;魏桃蘭;周安方;;中西醫(yī)結(jié)合治療弱精癥的臨床研究[A];第5次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合男科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編暨男科提高班講義[C];2007年

4 楊東;楊振洋;李寅如;路藝;;羅樸甫克比日丸聯(lián)合宜利康維參鋅膠囊治療少弱精癥198例療效觀察[A];首屆全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合男科論壇——暨第二次全國(guó)男科青年學(xué)術(shù)會(huì)議2012上海市中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)、中醫(yī)藥學(xué)會(huì)泌尿男科學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2012年

5 岳宗相;張培海;王久源;;育子湯加電針對(duì)弱精癥的療效觀察[A];首屆全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合男科論壇——暨第二次全國(guó)男科青年學(xué)術(shù)會(huì)議2012上海市中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)、中醫(yī)藥學(xué)會(huì)泌尿男科學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2012年

6 陳淼鑫;周從容;李榮榮;陳卓;羅錦;;促性腺激素結(jié)合卵胞漿內(nèi)單精子注射治療老年男性重度少弱精癥一例妊娠報(bào)告[A];第二屆西部地區(qū)（12省區(qū)）婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

7 郭軍;宋春生;史亞磊;耿強(qiáng);余國(guó)今;李延壽;楊陽;郭小舟;王國(guó)忠;;六五生精方治療少弱精癥療效的觀察[A];第5次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合男科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編暨男科提高班講義[C];2007年

8 溫保健;;自制生精丸治療少弱精癥療效觀察[A];第二次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合男科學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2003年

9 張春和;秦國(guó)政;李焱風(fēng);楊毅堅(jiān);張富剛;丁世霖;;黃地助育湯治療少弱精癥男性不育150例療效觀察[A];首屆岐黃男科論壇大會(huì)報(bào)告及論文匯編[C];2011年

10 余波瀾;劉丹;丁慶峰;黃朝峰;;lkBa基因多態(tài)性和人類弱精癥的相關(guān)性研究[A];中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)第九次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編（2009-2013）[C];2013年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前3條

1 通訊員 杜恩;常洗桑拿浴 易得弱精癥[N];家庭醫(yī)生報(bào);2009年

2 曹元成;淄博市中醫(yī)醫(yī)院一科研項(xiàng)目通過省級(jí)鑒定[N];淄博日?qǐng)?bào);2010年

3 深圳商報(bào)記者 張妍　通訊員 帥菲斐 林少霞;三成不孕癥問題在男方[N];深圳商報(bào);2010年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前8條

1 石理華;弱精癥精子蛋白質(zhì)差異表達(dá)變化及其在弱精癥中可能作用研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2012年

2 王富博;尿液lncRNA在前列腺癌早期診斷以及新型miRNA在進(jìn)展機(jī)制中的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

3 陳升東;精神分裂癥外周血單核細(xì)胞中差異性表達(dá)lncRNA的臨床和實(shí)驗(yàn)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

4 劉佳;靜態(tài)牽張力作用下健康和牙周病微環(huán)境來源PDLSCs生物學(xué)功能及LncRNA表達(dá)譜的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2016年

5 王舒婷;老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎寒/熱證型臨床觀察及膝軟骨LncRNA表達(dá)譜的初步研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2017年

6 顧成磊;高通量測(cè)序研究卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中異常lncRNA表達(dá)[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2017年

7 任晉東;LncRNA對(duì)鴨產(chǎn)蛋性能關(guān)鍵基因調(diào)控機(jī)理及其多態(tài)性研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2017年

8 崔軼;lncRNA對(duì)SPA作用下人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的作用及機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 傅建波;人成熟精子中l(wèi)ncRNA鑒定及其異常表達(dá)與弱精癥的相關(guān)性研究[D];南昌大學(xué);2017年

2 周俊豪;CRISP2蛋白在弱精癥精液精子中表達(dá)下調(diào)的分子機(jī)制及其臨床意義[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

3 宋元美;“促育生精方”調(diào)節(jié)環(huán)磷酰胺致少弱精癥模型大鼠精子特異性鈣通道CatSper1、CatSper2的機(jī)制研究[D];青島大學(xué);2015年

4 楊倩倩;補(bǔ)腎法治療少弱精癥隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的系統(tǒng)評(píng)價(jià)[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2016年

5 謝亞蘭;重度少弱精癥患者中醫(yī)體質(zhì)分型與ICSI治療結(jié)局的相關(guān)性研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2016年

6 賴誠(chéng)杰;通元針法對(duì)腎精虧虛型弱精癥精液質(zhì)量的影響[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2015年

7 周明;人胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜初步篩選及研究[D];蘇州大學(xué);2015年

8 郝超;LncRNA在前列腺增生性炎性萎縮向前列腺癌惡性轉(zhuǎn)化過程中差異表達(dá)的初步研究[D];南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院;2015年

9 金雯;基于結(jié)構(gòu)的植物lncRNA相互作用研究[D];吉林大學(xué);2016年

10 孫影;基于miRNA的lncRNA和mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[D];吉林大學(xué);2016年

，

本文編號(hào)：2422215