發(fā)布時(shí)間：2019-01-27 09:42

【摘要】：研究背景： 細(xì)胞因子信號(hào)抑制蛋白3(suppressor of cytokine signaling3，SOCS3)是一種重要的誘導(dǎo)性抗腫瘤分子,可誘導(dǎo)表達(dá)于包括肝細(xì)胞在內(nèi)的多種組織細(xì)胞。其由N端可變區(qū)、中央核心SH2結(jié)構(gòu)區(qū)和C末端的SOCS盒區(qū)組成。SOCS3作為JAK-STAT信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，在抑制腫瘤中生長(zhǎng)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。一方面SOCS3可以誘導(dǎo)P21的表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖；另一方面過(guò)表達(dá)SOCS3后，可以下調(diào)Bcl-2同時(shí)上調(diào)Casepase3，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。但是目前對(duì)于研究Socs3基因表達(dá)調(diào)控的領(lǐng)域較少。肝X受體(liver X receptor，LXR)為配體依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄因子，是核受體的一種，作為一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，LXR廣泛參與調(diào)節(jié)物質(zhì)(糖、脂和膽固醇)代謝以及抗炎、神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病。近年研究表明，抗腫瘤作用是LXR的一項(xiàng)新功能，其在抑制不同種類(lèi)的腫瘤細(xì)胞系增殖方面有著重要的作用如肝細(xì)胞癌，前列腺癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，宮頸癌，淋巴癌，卵巢癌等，但是其具體的抗腫瘤機(jī)制仍不是十分清楚。既然LXR和SOCS3都具有抗腫瘤的功能，而且SOCS3在腫瘤細(xì)胞中處于地表達(dá)或者不表達(dá)狀態(tài)，那么LXR能否通過(guò)促進(jìn)SCOS3的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤的功能，目前尚無(wú)報(bào)道。作為甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，5-氮雜-2＇-脫氧胞苷能使腫瘤細(xì)胞周期阻滯在G2期，但這一過(guò)程具體的分子機(jī)制仍不清楚。 研究目的：研究LXR調(diào)控SOCS3表達(dá)的分子機(jī)制以及SOCS3在抑制肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)細(xì)胞系增殖中的作用以及5-氮雜-2＇-脫氧胞苷導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周期阻滯的分子機(jī)制。 研究方法： (1)用LXR的兩種激動(dòng)劑TO901317和GW3965處理兩種肝癌細(xì)胞系HepG2和Hep3B，提取m-RNA、逆轉(zhuǎn)錄成c-DNA、進(jìn)而通過(guò)RT-PCR和QRT-PCR檢測(cè)Socs3基因的表達(dá)情況；提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，通過(guò)Western blot檢測(cè)SCOS3以及CylinD1、P21和P27的表達(dá)情況。 (2)在核受體網(wǎng)站上預(yù)測(cè)SOCS3的啟動(dòng)子區(qū)是否存在LXR的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建SOCS3上游啟動(dòng)子區(qū)的重組質(zhì)粒，進(jìn)而用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)LXR激動(dòng)劑對(duì)SOCS3啟動(dòng)子活性的影響。 (3)通過(guò)CCK-8和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)LXR激動(dòng)劑對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。 (4)用siRNA干擾肝癌細(xì)胞系SOCS3后，檢測(cè)LXR激動(dòng)劑對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2和Hep3B細(xì)胞增殖、周期的影響以及用WB檢測(cè)相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白cyclin D1，p21和p27的表達(dá)情況。 (5)對(duì)裸鼠腋下進(jìn)行異種移植肝癌細(xì)胞系HepG2，當(dāng)腫瘤形成后，對(duì)荷瘤鼠腹腔注射TO901317(25mg/kg/d)，觀察TO901317對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響以及用QRT-PCR,WB以及免疫組化檢測(cè)SOCS3mRNA和蛋白水平的變化。 (6)5-氮雜-2＇-脫氧胞苷處理細(xì)胞后，CCK-8和流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞增殖和周期。 (7)半定量PCR檢測(cè)SOCS3和甲基化轉(zhuǎn)移酶的mRNA水平，WB檢測(cè)SOCS3和p21的水平。 (8)干擾SOSS3后，WB檢測(cè)5-氮雜-2＇-脫氧胞苷對(duì)p21蛋白水平的影響。 研究結(jié)果： (1) LXR的兩種激動(dòng)劑TO901317和GW3965能夠劑量依賴(lài)的上調(diào)SOCS3蛋白和m-RNA的水平。 (2) LXR激動(dòng)劑不能上調(diào)SOCS3的啟動(dòng)子活性,導(dǎo)致SOCS3mRNA上調(diào)的原因是因?yàn)長(zhǎng)XR激動(dòng)劑增加了SOCS3mRNA的穩(wěn)定性。 (3) TO901317能夠劑量依賴(lài)的抑制肝癌細(xì)胞系HepG2增殖并且將細(xì)胞周期阻滯在G1期。 (4)干擾SOCS3的表達(dá)后削弱了LXR抗腫瘤細(xì)胞增殖的效應(yīng)。 (5)在裸鼠肝細(xì)胞癌皮下異種移植瘤模型中，TO901317能夠抑制荷瘤鼠HCC的生長(zhǎng)以及上調(diào)SOCS3蛋白和mRNA的水平。 (6)5-氮雜-2＇-脫氧胞苷能夠使腎癌細(xì)胞周期抑制在G2期，抑制細(xì)胞增殖。 (7)5-氮雜-2＇-脫氧胞苷能降低DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1/3a的mRNA水平和提高SOCS3的mRNA水平，也能提高SOCS3和p21的蛋白水平。 (8)在干擾SOCS3后，5-氮雜-2＇-脫氧胞苷誘導(dǎo)p21蛋白水平增加的作用減弱。 結(jié)論： (1) LXR激動(dòng)劑通過(guò)增強(qiáng)SOCS3mRNA的穩(wěn)定性從而導(dǎo)致SOCS3m-RNA和蛋白的水平的上調(diào)。 (2)在肝癌細(xì)胞系HepG2和Hep3B中，LXR激動(dòng)劑能夠通過(guò)上調(diào)SOCS3,從而降低cyclin D1的蛋白水平，升高p21和p27的蛋白水平，使細(xì)胞阻滯在G1期，最終抑制細(xì)胞的增殖。 (3)5-氮雜-2＇-脫氧胞苷能恢復(fù)SOCS3的表達(dá)，，從而誘導(dǎo)p21的蛋白水平升高，最終使腎癌細(xì)胞周期阻滯在G2期。
[Abstract]:Study Background: The cytokine signal-inhibiting protein 3 (SOCS3) is an important inducible anti-tumor molecule, which can be induced to be expressed in a variety of tissues, including liver cells. a cell comprising an N-terminal variable region, a central core SH2 structure region and a C-terminal SOCS box region group, As a negative regulator of JAK-STAT signal pathway, SOCS3 plays an important role in inhibiting the growth of tumor and promoting the apoptosis of tumor cells. On the one hand, SOCS3 can induce the expression of P21 and then inhibit the proliferation of cells. On the other hand, after the expression of SOCS3, Bcl-2 can be down-regulated while the Casepase3 is up-regulated, thus promoting the growth of tumor cells. However, in the field of research on the regulation of the expression of Socs3 gene, Low. The liver X receptor (LXR) is a ligand-dependent transcription factor, a kind of nuclear receptor, as a multi-function transcription factor, LXR is widely involved in the regulation of metabolism of substances (sugar, fat and cholesterol) and anti-inflammatory, neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease. Recent studies have shown that the anti-tumor effect is a new function of LXR, which plays an important role in inhibiting the proliferation of different types of tumor cell lines, such as hepatocellular carcinoma, prostate cancer, breast cancer, colon cancer, cervical cancer, lymphoma, and ovarian cancer. and the like, but the specific anti-tumor mechanism is not very clear. If LXR and SOCS3 both have anti-tumor function, and SOCS3 is in the expression or non-expression state in tumor cells, the ability of LXR to play an anti-tumor function by promoting the expression of SCOS3 is not yet reported. As a methyltransferase inhibitor, the 5-nitroza-2 '-donor cell can block the cell cycle of the tumor in the G2 phase, but the molecular mechanism of this process is still unclear. Objective: To study the molecular mechanism of the expression of SOCS3 by LXR and the role of SOCS3 in the inhibition of the proliferation of the human hepatocellular carcinoma (HCC) cell line and the division of the cell cycle of the tumor. a sub-mechanism. Methods: (1) Two kinds of liver cancer cell lines HepG2 and Hep3B were treated with two agonists TO901317 and GW3965 of LXR, and m-RNA and reverse transcription c-DNA were extracted, and then the expression of the Socs3 gene was detected by RT-PCR and QRT-PCR, and the total protein in the cells was extracted, and the SCOS3 was detected by Western blot. CylinD1, P21 and P and (2) predicting the binding site of the LXR in the promoter region of the SOCS3 on the nuclear receptor website, constructing a recombinant plasmid of the upstream promoter region of the SOCS3, 3) Detection of LXR Agonist by CCK-8 and Flow Cytometry in the Treatment of Hepatocarcinoma Cell Line HepG2 The effect of LXR agonist on the proliferation and cycle of HepG2 and Hep3B cells of the liver cancer cell line HepG2 and Hep3B was detected by siRNA, and the corresponding cell cycle protein cyclin D1 was detected by WB. and the expression of p21 and p27. (5) Xenograft hepatoma cell line HepG2 was carried out on the underarm of nude mice. After the tumor was formed, the tumor-bearing mice were injected with TO901317 (25mg/ kg/ day), and the effect of TO901317 on the growth of the tumor was observed and the SO-PCR, WB and immunohistochemistry were used to detect the SO. Changes in the level of CS3 mRNA and protein. (6) After 5-nitroza-2'-yeast cell-treated cells, CC K-8 and flow cytometry for cell proliferation and cycle. (7) Semi-quantitative PCR to detect the mRNA of SOCS3 and methyltransferase Level, WB detects levels of SOCS3 and p21. (8) After interference with SOSS3, WB detects 5-N-to-2 '-The effect of cytoskeleton on the level of p21 protein. Results: (1) Two agonists of LXR, TO901317 and GW3965 Up-regulation of the level of SOCS3 protein and m-RNA can be dose-dependent. (2) LXR agonists cannot upregulate the promoter activity of SOCS3, resulting in an up-regulation of SOCS3 mRNA The reason is that the LXR agonist increases the stability of the SOCS3 mRNA. (3) The TO901317 can be dose-dependent The inhibition of the proliferation of the liver cancer cell line HepG2 and the cell cycle arrest in the G1 phase. (4) The effect of the proliferation of LXR anti-tumor cells was weakened after interfering with the expression of SOCS3. (5) In the subcutaneous xenograft model of nude mice, TO90131 7 can inhibit the growth of the tumor-bearing mouse HCC and increase the level of the SOCS3 protein and the mRNA.) 5-aza-2'-pyocyanin can inhibit the cell cycle of the kidney cancer in the G2 phase and inhibit cell proliferation. (7) 5-aza-2 '-pyocyanin can reduce the mRN of the DNA methyltransferase 1/ 3a. The level of the mRNA of SOCS3 and the level of the protein of SOCS3 can be increased, and the level of the protein of SOCS3 and p21 can be improved. (8)) in dry Conclusion: (1) LXR Agonists increase the level of SOCS3-RNA and protein by enhancing the stability of SOCS3 mRNA. (2) In the liver cancer cell lines HepG2 and Hep3B, LXR agonists can reduce cyc by up-regulation of SOCS3. lin D1 protein level, increase the protein level of p21 and p27, block the cell in G1 phase, and finally inhibit cell proliferation. (3) 5-nitroza-2'
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7;R737.11

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本文編號(hào)：2416145