【摘要】：第一部分：前列腺癌細(xì)胞系中與LEF1相關(guān)miRNAs高通量篩選及驗(yàn)證 目的篩選并驗(yàn)證與LEF1相關(guān)的miRNAs表達(dá)變化。 方法利用3種前列腺癌細(xì)胞系LNCaP (LEF1低表達(dá)),]NCaP-AI (LEF1高表達(dá))和LNCaP-AIshLEF1(LEF1低表達(dá))做miRNA基因芯片分析。利用TaqMan探針實(shí)時(shí)定量PCR技木驗(yàn)證miRNA基因芯片結(jié)果。 結(jié)果在miRNA基因芯片所覆蓋的687個(gè)miRNAs中,通過LNCaP-AI/LNCaP和LNCaP-AI/LNCaP-AILEF1shRNA兩組數(shù)據(jù)做聚類分析發(fā)現(xiàn)共有18個(gè)miRNAs有超過2倍的表達(dá)水平差異,其中LNCaP-AI/LNCaP組中miR-34a表達(dá)下調(diào)了6.97倍,而miR-181a上調(diào)了12.36倍。利用TaqMan探針實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)驗(yàn)證表達(dá)上調(diào)及下調(diào)變化排在前9的miRNAs,發(fā)現(xiàn)miR-34a及miR-181a實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致,而且表達(dá)變化差異分別位于下調(diào)和上調(diào)中最高。 結(jié)論在前列腺癌細(xì)胞系中,miR-34a與LEF1基因表達(dá)負(fù)相關(guān),miR-181a與LEF1基因表達(dá)正相關(guān),故選擇miR-34a和miR-181a做進(jìn)一步研究。 第二部分：miR-34a及miR-181a對體外前列腺癌EMT及侵襲功能研究 目的體外實(shí)驗(yàn)探討miR-34a及miR-181a調(diào)控前列腺癌細(xì)胞EMT及侵襲功能 方法利用化學(xué)合成的miR-34a或miR-181a模擬物及抑制物模擬過表達(dá)或低表達(dá)特定microRNA;選擇E-cadherin及N-cadherin作為EMT標(biāo)志物,Western-blot檢測其蛋白表達(dá)水平；BD基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)及transwell小室檢測侵襲及遷移能力。 結(jié)果在LNCaP-AI和C4-2B細(xì)胞中,miR-34a抑制EMT及侵襲能力,而miR-181a抑制物抑制EMT及侵襲能力；在LNCaP和C4-2B細(xì)胞中,miR-34a抑制物促進(jìn)EMT及侵襲能力,而miR-181a促進(jìn)EMT及侵襲能力。 結(jié)論前列腺癌中,miR-34a抑制EMT及侵襲能力,miR-181a促進(jìn)EMT及侵襲能力。 第三部分：LEF1與m i R-34a及miR-181a作用機(jī)制研究 目的探索miR-34a、LEF1和miR-181a三者之間調(diào)控作用關(guān)系 方法TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR及Western-blot檢測基因及蛋白表達(dá)水平變化；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-34a特異性結(jié)合LEF13'UTR;利用ChIP方法分析LEF1對miR-181a啟動(dòng)子區(qū)域調(diào)控作用。 結(jié)果miR-34a通過靶向結(jié)合LEF13'UTR在mRNA水平及蛋白水平負(fù)向調(diào)控LEF1,miR-34a在mRNA水平同時(shí)負(fù)向調(diào)控LEF1及miR-181a。LEF1在轉(zhuǎn)錄水平靶向結(jié)合has-miR-181a-2上游啟動(dòng)子區(qū)域促進(jìn)miR-181a表達(dá)。 結(jié)論miR-34a-LEF1-miR-181a調(diào)控軸在前列腺癌EMT及侵襲中起到重要調(diào)節(jié)作用。
[Abstract]:Part I: high throughput screening and validation of miRNAs associated with LEF1 in prostate cancer cell lines; objective to screen and verify the changes of miRNAs expression associated with LEF1. Methods three prostate cancer cell lines, LNCaP (low expression of LEF1), NCaP-AI (high expression of LEF1) and LNCaP-AIshLEF1 (low expression of LEF1), were used for miRNA microarray analysis. The results of miRNA gene chip were verified by real time quantitative PCR with TaqMan probe. Results among the 687 miRNAs covered by miRNA gene chip, there were more than 2 times difference in expression level of 18 miRNAs by cluster analysis of LNCaP-AI/LNCaP and LNCaP-AI/LNCaP-AILEF1shRNA data. In LNCaP-AI/LNCaP group, the expression of miR-34a decreased by 6.97 times, and miR-181a increased by 12.36 times. TaqMan probe real-time quantitative PCR technique was used to verify that the miR-34a and miR-181a real-time quantitative PCR results were consistent with the gene chip results, and the difference was the highest in down-regulation and upregulation, respectively. Conclusion there is a negative correlation between miR-34a and LEF1 gene expression in prostate cancer cell line, and a positive correlation between miR-181a and LEF1 gene expression. Therefore, miR-34a and miR-181a are selected for further study. Part two: study on the function of miR-34a and miR-181a on EMT and invasion of prostate cancer in vitro objective to investigate the effect of miR-34a and miR-181a on the regulation of EMT and invasive function of prostate cancer cells by chemical synthesis in vitro MiR-34a or miR-181a mimics and their inhibitors mimic overexpression or low expression of specific microRNA; E-cadherin and N-cadherin were selected as EMT markers and their protein expression levels were detected by Western-blot. Invasion and migration ability were detected by BD matrix invasion assay and transwell chamber. Results in LNCaP-AI and C4-2B cells, miR-34a inhibited EMT and invasion, while miR-181a inhibited EMT and invasion. In LNCaP and C4-2B cells, miR-34a inhibitor promoted EMT and invasion ability, while miR-181a enhanced EMT and invasion ability. Conclusion in prostate cancer, miR-34a inhibits EMT and invasiveness, miR-181a promotes EMT and invasiveness. Part three: study on the interaction Mechanism of LEF1 with MiR-34a and miR-181a objective to explore the regulatory relationship between miR-34a,LEF1 and miR-181a; TaqMan real-time quantitative PCR and Western-blot were used to detect the changes of gene and protein expression levels. Double luciferase reporter gene experiment verified that miR-34a specifically combined with LEF13'UTR; to analyze the role of LEF1 in the regulation of miR-181a promoter region by ChIP method. Results miR-34a negatively regulated LEF1, at mRNA level and protein level by targeting LEF13'UTR. MiR-34a negatively regulates both LEF1 and miR-181a.LEF1 at the mRNA level at the transcriptional level targeting the upstream promoter of has-miR-181a-2 to promote miR-181a expression. Conclusion the miR-34a-LEF1-miR-181a regulatory axis plays an important role in the regulation of EMT and invasion of prostate cancer.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.25

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2407235